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不同泌乳期奶山羊乳腺OPN基因表达及其对MCF-7细胞生长的影响
孙杰1, 罗军2, 刘俊霞2, 李大全1
1. 石河子大学动物科技学院, 石河子 832003,
2. 西北农林科技大学动物科技学院, 杨凌 712100
摘 要: 为了研究骨桥蛋白基因(OPN)在奶山羊(Capra hircus)乳腺组织不同泌乳期的变化规律及其功能, 采用SYBR Green染料建立该基因的实时荧光定量PCR(QPCR)分析方法, 以-actin基因为内参, 对该基因在乳腺组织泌乳28 d、60 d、100 d、190 d、270 d和330 d的mRNA表达水平进行检测, 同时将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1, 构建重组质粒pcDNA3.1-OPN, 所获重组质粒经过酶切和测序鉴定后, 转染MCF-7细胞, 采用M论文范文(四唑盐, 3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromid)法检测OPN对MCF-7细胞的增殖差异, 结果表明: OPN基因在泌乳初期(28 d)和泌乳后期(190 d)表达水平较高, 干奶期最低, 其表达水平总体呈现高-低-高-低的变化模式.M论文范文实验表明转染OPN基因的MCF-7细胞较未转染基因组细胞的生长具有显著差异(P&,lt,0.05), 说明OPN的表达具有促进MCF-7细胞生长的作用.
乳腺癌基因检测:乳腺癌 基因检测-预知乳腺癌
关键词: 奶山羊, 乳腺组织, 骨桥蛋白基因, 荧光定量PCR, 细胞生长
Expression of OPN gene during different lactation stages in mammary gland of dairy goat and its effect on growth of MCF-7 cell line
SUN Jie1, LUO Jun2, LIU Jun-Xia2, LI Da-Quan1
1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, China,
2. College of Animal Science and Technology, Northwest A&,F University, Yangling 712100, China
Abstract: To investigate the expression pattern and preliminary function of OPN gene in mammary gland of dairy goat during different lactation stages, using -actin gene as the internal control, the SYBR Green quantitative real-time PCR (QPCR) analysis was conducted to determine the mRNA expression of OPN gene in mammary gland at the 28th, 60th, 100th, 190th, 270th and 330th day after kidding. Recombinant pla论文范文id of pcDNA3.1-OPN was constructed by inserting the fragment of OPN gene into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 and used to tran论文范文ect the MCF-7 cell line following the restrictive endonuclease cle论文范文age and sequence identification of the target gene segment, the effect of OPN gene on MCF-7 cell proliferation was assessed by M论文范文 analysis. The results indicated that OPN gene exhibited the higher expression level in early (28 d) and late (190 d) lactation stages and the lowest level at dry stage (330 d), which demonstrated a high-low-high-low pattern. There was a significant difference (P &,lt, 0. 05) in the proliferation between OPN gene tran论文范文ected and non-tran论文范文ected MCF-7 cells, which suggested that the expression of OPN gene could stimulate the proliferation of MCF-7 cells.
Keywords: dairy goat, mammary gland, OPN gene, real-time PCR, cell proliferation
骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是细胞外基质中重要的功能性蛋白, 因其最早发现于牛骨组织的成骨细胞与破骨细胞之内, 介导骨组织细胞与骨基质的连接, 参与骨基质矿化和重吸收过程而得名[1].随着研究的深入, 在许多非矿化组织如乳腺、肾、内耳、胎盘、平滑肌及活化T细胞、巨噬细胞等之中亦发现有OPN的存在, OPN蛋白是一种亲水性的分泌型酸性糖蛋白, 多以磷酸化形式存在, 参与细胞信号转导, 可促进细胞的趋化、黏附和迁移, 含有特异性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)基序, 该基序高度保守, 对OPN的黏附功能起着重要作用.在不同物种中OPN均普遍存在, 骨桥蛋白基因的表达具有组织细胞特异性, 并且受多种激素、生长因子、原癌基因表达产物的调控[2].OPN在怀孕和泌乳期的小鼠乳腺上皮细胞中表达是乳腺形态维持的重要调控因子, 并影响乳腺上皮细胞的分化, 对出生后乳腺的发育起着重要作用[3, 4], 有研究报道骨桥蛋白是影响奶牛产奶量和乳成分的QTL, 是具有重要功能的候选基因[5].
奶山羊的一个泌乳周期中乳腺经历着规律性的变化, 随着分子生物学的快速发展, 人们认识到乳腺泌乳功能的变化是由其自身基因表达的时空变化引起的, 从分子水平揭示OPN基因在乳腺泌乳期的变化规律, 并分析载有OPN基因的质粒对乳腺上皮细胞生长的影响, 对阐明乳腺泌乳的分子机理, 调控乳成分, 提高产奶量具有重要意义.本研究采用实时荧光定量PCR研究OPN基因在奶山羊乳腺组织不同泌乳阶段表达量的变化差异, 并构建OPN基因的真核表达载体, 转染MCF-7细胞, 对西农萨能羊乳腺OPN基因功能进行初步研究, 为奶山羊乳腺发育的基因调控研究提供试验依z据.
1. 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与样品采集
试验选用西北农林科技大学萨能羊原种场健康的纯种西农萨能羊(3岁, 第二胎)为试验材料, 分别在泌乳初期(28 d)、盛期(60 d)、中期(100 d)、后期(190 d)、末期(270 d)和干奶期(330 d)(每个时期随机选择3只西农萨能羊)用手术法采集乳腺腺泡组织样品 1 g左右放于DEPC水处理的1.5 mLEP管中, 并立即投入液氮中冷冻, 随后保存-80℃冰箱备用.选用MCF-7细胞(本身不表达OPN基因[14])做转染, 购自中科院上海细胞库.
1.1.2 主要试剂
ABI PRI论文范文s 7900HT Thermal cycler PCR仪, RibolockTM Ribonuclease Inhibitor、TaqDNA论文范文酶、Rever-tAidTM MMLV Reverse Transcriptase、RT反应试剂盒、RevertAid TM First strand cDNA Synthesei Kit购自Fermentans公司, PGEM-Teasy vector购自美国Promega公司, 2×SYBTPremix×Ex TaqTM试剂盒购自TaKaRa生物公司.自制感受态Escherichia coli DH5α, 引物合成和DNA测序由上海生工生物工程技术服务公司完成.pcDNA3.1/myc-His(-) A真核表达载体购自Invitrogen公司、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)均购自TaKaRa生物公司.DMEM-F12细胞培养基购自GIBCO公司, 去内毒素质粒提取试剂盒购自Qiagen公司, VigoFect细胞转染试剂购自威格拉斯公司, 胰蛋白酶、EDTA购自Sigma公司.
1.2 方法
1.2.1 RNA提取
Trizol法提取乳腺组织和MCF-7细胞中的总RNA.
1.2.2 反转录合成cDNA
利用RevertAidTM First strand cDNA Syntthese Kit试剂盒进行反转录得到第一链cDNA.具体步骤:分别取每个样品总RNA约4 g加入到0.2 mL的PCR管中, 加入Oligo (dt)1 L, 用DEPC水补充体积至12 L, 混匀后70℃ 5 min孵育, 依次加入4 L的5×reation buffer, 1 L的RibolockTM Ribonuclease Inhibitor, 2 L的10 mmol/L dNTP mix, 混匀后37℃5 min.然后加入1 L的RevertAidTm-Mulv Reverse Transcriptase, 使终体积为20 L.混匀后42℃孵育60 min, 然后70℃孵育10 min, 20℃保存.
1.2.3 荧光定量PCR
从NCBI数据库下载西农萨能羊的OPN (EU29 5699)和-actin (AF481159)基因的mRNA序列, 利用软件Primer5.0设计引物.OPN实时定量引物F1: 5′-G论文范文AAACCGACCAG论文范文CTGGCA-3′, 引物R1: 5′-G论文范文GTCATCAG论文范文TCCTCAGAGG-3′ (产物大小为153 bp), 扩增反应条件为: 94℃热变性4 min, 95 ℃ 15 s, 53℃ 15 s, 72℃ 20 s, 40个循环, 72℃ 10 min, 山羊-actin正向引物F2: 5′-GGCACCACACC论文范文CTA CAACG-3′, 反向引物R2: 5′-GC论文范文CC论文范文GATGTCAC GGACG-3′, 扩增片段长度为277 bp, PCR反应条件为: 94℃预变性4 min, 95℃变性15 s, 54℃复性20 s, 72℃延伸20 s, 40个循环, 72℃ 10 min.实时荧光定量PCR反应体系20 L: 含有SYBR Green I的2×SYBT Premix mix 10 L, 正、反向引物各0.8 L, 各个泌乳时期的cDNA为模板2 L和H2O 6.4 L, 每个样品做3个重复, 计算结果取平均值.
计算方法根据Livak和Schmittgen[6]数学推导得出目的基因的变化倍数等于2Ct, 公式中, Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值, ⊿Ct 等于 (Ct目的基因Ct内参基因), ⊿⊿Ct 等于(Ct试验组1目的基因Ct试验组1内参基因) (Ct试验组2目的基因Ct试验组2内参基因), 2Ct表示的就是试验组1目的基因的表达相对于试验组2的变化倍数.
1.2.4 表达载体的构建
OPN基因的RT-PCR扩增: 根据OPN基因的完整开放阅读框和pcDNA3.1真核表达载体设计引物, 并且在上游引物的5′端插入一个BamHⅠ酶切位点, 在下游引物的5′端插入一个HindⅢ酶切位点.上游引物F3: 5′-CGGGATCCATGAGAA论文范文GCAGTGAT 论文范文GC-3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点), 下游引物R3: 5′-CCAAGC论文范文TCAG论文范文GACCTCAGAAGAG G-3′(划线部分为HindⅢ酶切位点).PCR反应体系25 L: 10×(NH4)2SO4 buffer 2.5 L, MgCl2 buffer 1.5 L, dNTP (10 mmol/L)0.5 L, 引物F3(10 mol/L)和R3(10 mol/L)各0.5 L, TaqDNA论文范文酶(5 U/L) 0.2 L, cDNA模板0.5 L, 加去离子水18.8 L.PCR扩增条件: 95℃ 5 min, 94℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 50 s, 35个循环, 72℃ 10 min, 得到单一清晰条带后回收, 与PGEM-T载体连接, 转化感受态Escherichia coli DH5, 在铺有40 L IPTG和7 L X-gal的氨苄青霉素琼脂平板上进行蓝、白斑筛选, 挑取白色菌落于含抗生素的LB液体中摇菌12~16 h, 碱裂解法提取质粒DNA, BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆载体, 获得带双酶切位点的OPN基因(酶切体系: 2 L10×K buffer, 0.6 L BamHⅠ(15 U/L)和HindⅢ(15 U/L), 10 L质粒, 补水至20 L), 将酶切鉴定正确的克隆送上海生工测序, 测序正确的克隆酶切后的片段用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离, 玻璃奶法纯化, 将带BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的目的片段分别克隆到有同样酶切位点的pcDNA3.1线性化载体上, 从而构建重组载体pcDNA3.1-OPN, 将重组阳性的质粒送上海生工序列测定, 验证重组质粒读码框正确性.
1.2.5 重组质粒转染MCF-7细胞
将购买到的MCF-7细胞培养在37℃、5% CO2培养箱中, 观察细胞生长状态和形态, 连续传代两次, 转染前将细胞接种于96孔板中培养, 待每孔中细胞生长密度达70%~80%后, 按VigoFect细胞转染试剂说明书进行转染.同时以不含OPN基因片段的pcDNA3.1质粒作为空载体转染细胞, 操作方法同重组质粒pcDNA3.1-OPN.
1.2.6 M论文范文法测定细胞增殖反应性
实验设转染OPN组细胞(pcDNA3.1-OPN ) 、空载体组(pcDNA3.1)细胞和不转染组(对照)共三组.以每孔1×104细胞接种于96孔培养板(200 L/孔) , 每组细胞设6个复孔, 于37℃、5%CO2培养箱中培养.24 h后每孔加入M论文范文(5 mg/mL)20 L, 37℃继续孵育4 h, 弃上清, 每孔加入150 L二论文范文亚砜(DMSO), 轻柔振荡10 min, 充分溶解结晶, 对3组的6个复孔进行测量, 选择490 nm波长, 在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值, 以仅培养液、M论文范文、二论文范文亚砜的组为空白调零孔, 其它组试验步骤完全相同.用M论文范文法检测各孔吸光度(OD)值, 计算细胞增殖率等于OD实验组/OD对照组×100%.
1.2.7 半定量RT-PCR
OPN引物的设计参照实时定量引物, 以NCBI数据库人的β-actin (NM_001101)基因为内参, 上游引物5′-GCACCACACC论文范文CTACAATG AGC-3′, 下游引物: 5′-ATGAGGTAGTCAGTCA GGTCCC-3′, 扩增片段长度为283 bp, PCR反应条件为: 94℃预变性4 min, 95℃变性15 s, 54℃复性15 s, 72℃延伸20 s, 40个循环, 72℃ 10 min.反应体系为: cDNA膜板1 L, TaqDNA论文范文酶 (5 U/L) 0.2 L, 10×(NH4)2SO4 buffer 2.5 L, Mgcl2 buffer 1.5 L, 0.5 LdNTP (10 mol/ L), 上下游引物各0.5 L(10 mol/L), 加ddH2O至25 L.
1.2.8 数据分析
数据采用SPSS13.0软件中的ANOVA对细胞的吸光度值进行统计分析, 用LSD检验确定差异显著性.
2. 结果与分析
2.1 RNA的纯度与完整性
所提取的RNA样本用分光光度计测定OD260/ OD280均为1.8~2.0, 经凝胶变性电泳鉴定, 28S、18S条带清晰可见, 无明显降解, RNA质量符合实验要求.
2.2 OPN基因mRNA丰度变化
采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法, 以6个不同泌乳期cDNA为模板检测OPN基因在不同泌乳期乳腺组织中的表达变化.以初期(28 d)、盛期(60 d)、中期(100 d)、后期(190 d)、末期(270 d)和干奶期(330 d)为横坐标, OPN mRNA相对表达水平的差异倍数为纵坐标, 泌乳初期到干奶期OPN基因的动态表达水平见图1, 差异倍数的计算采用数学公式[6], 得出目的基因的变化倍数等于2⊿⊿Ct 其中-actin基因对表达水平进行均一化, 并定义OPN基因在泌乳330 d的乳腺组织中相对表达水平为1, 以对该基因在其他泌乳期的表达水平进行相对定量.
OPN基因在泌乳初期乳腺中的表达丰度相对值最高, 其次是泌乳后期、末期、盛期和中期, 干奶期.说明在泌乳初期OPN基因表达水平最高, 极显著(P&,lt,0.01)高于其他泌乳期, 随着奶产量的增加泌乳盛期OPN基因的表达量呈现下调趋势, 进入奶产量下降阶段即泌乳后期OPN基因的表达开始增加, 显著(P&,lt,0.05)高于盛期、中期、末期和干奶期, 整个泌乳期的变化呈现高-低-高-低, 在干奶期表达最低的趋势.其中泌乳28 d时的相对表达水平约为干奶期330 d的11.7倍.
2.3 pcDNA3.1-OPN重组载体的构建与酶切鉴定
将鉴定正确的pGEM-T-OPN质粒及pcDNA3.1分别进行双酶切(图2: A、B), 图2A出现1条长约900 bp的目的条带, 回收纯化酶切目的产物后进行连接、转化抗性平板初筛、抽提质粒分别进行双酶切及PCR鉴定, 双酶切电泳分析结果出现2条带, 其中1条为载体质粒, 约5.4 kb, 另1条为OPN基因的条带, 约900 bp(图2C).各片段大小均与其理论值相符, 表明真核表达质粒构建成功.
2.4 OPN基因对细胞生长的影响
将各组细胞接种于96孔板中, 转染去内毒素质粒pcDNA3.1-OPN和pcDNA3.1于MCF-7细胞后, 利用M论文范文法检测重组载体组、空载体组及对照组在490 nm的吸光度值(表1), 将所测结果进行统计学分析, 结果显示: 转染pcDNA3.1-OPN 的细胞较转染pcDNA3.1的细胞和对照细胞组的吸光度值差异显著(P&,lt,0.05), 表明转染OPN基因后细胞活性明显升高, 细胞的生长速度加快, 且转染目的基因组pcDNA3.1-OPN的细胞增殖率111.4%高于未转染目的基因组pcDNA3.1的101.3%, 说明OPN蛋白对MCF-7的细胞增殖有促进作用.
2.5 RT-PCR检测转染细胞中OPN mRNA的表达
RT-PCR半定量的结果表明: 以-actin为内参, 转染pcDNA3.1-OPN的MCF-7细胞中有OPN基因的表达, 而未转染和转染pcDNA3.1空质粒的MCF-7细胞均未见OPN基因的表达(图3).
3. 讨 论
乳腺是一个非常复杂的器官, 当母畜分娩时, 垂体分泌大量的催乳素, 乳腺开始正常的分泌活动.一般母羊产羔20 d后, 因催乳素作用强烈, 加上干奶期的营养贮备, 产奶量迅速上升, 到产后40-70天, 达到最高峰.180 d以后, 产奶量缓慢下降, 特别是210 d后, 下降的幅度较快, 至300 d停止泌乳进入干奶期.母羊分娩从开始泌乳到进入产奶高峰期, 再下降进入干奶期停止泌乳, 形成了一个抛物线形的泌乳曲线.本实验运用实时定量PCR研究OPN在不同泌乳期乳腺组织中mRNA表达水平变化,结果呈现高-低-高-低, 最后在干奶期表达最低的趋势, 这与奶山羊泌乳曲线的变化趋势不完全一致, 而与乳中蛋白质含量、脂肪含量的变化[7]有相同之处, 都表现在泌乳初期含量高, 随着奶产量的升高其含量开始下降, 到泌乳后期奶产量下降其含量又有所上升的趋势.在对奶牛乳腺中OPN基因的研究也有类似的报道, OPN基因在荷斯坦奶牛泌乳期与干奶期的表达差异显著, 其中泌乳期OPN基因的表达量是干奶期的8倍[8],
Leonard等[9]研究认为奶牛乳腺中OPN基因可能与其连锁的不平衡基因影响乳蛋白的百分率, Khatib等[10]报道OPN在不同奶牛群体中的差异与乳成分性状(乳脂肪百分率、乳蛋白百分率等)有显著关系.Ron等[11]研究认为一个影响乳蛋白百分率有关的QTL与OPN基因区域相差4 cM, 奶牛6号染色体上420 kb区域有OPN的突变点已被认为是一个潜在的功能位点, OPN的杂合子和纯合子有不同的SNP位点.通过对本次实验泌乳初期和末期的相对含量分析, 发现初期的表达量比末期高3.9倍左右, 进一步说明, 在妊娠后期OPN基因就开始表达, 与OPN基因在牛及小鼠上的研究结果一致[8, 12, 13], 综合以往研究和本次实验结果, 推测OPN在乳腺周期性的变化中发挥重要的生理功能, 并可能影响产奶性状.
本实验结果和以往研究报道均表明OPN基因存在于哺乳动物乳腺中, 但在不同细胞系中的表达情况有所差别, MCF-7细胞本身无OPN基因表达[14], 为了研究奶山羊乳腺中OPN基因的功能, 本研究构建了pcDNA3.1-OPN重组载体, 并转染MCF-7细胞发现OPN基因的表达对MCF-7的细胞增殖具有促进作用, 这与Das等[15]报道的OPN基因具有促进细胞增殖的作用结论相一致, 且在转染OPN基因的MCF-7细胞检测到了该基因的表达, 这为今后奶山羊乳腺发育的深入研究奠定了基础.OPN与乳腺组织间的关系报道见于20世纪90年代, Rittling等[12]检测小鼠乳腺发育不同阶段的OPN表达状况, 结果发现, 乳腺由静止期发育至妊娠期时, OPN的表达由低水平发展至中等水平, 至泌乳第2 d时达到高峰, 此后则缓慢下降并在乳腺复旧期内保持一个较高的水平.Nemir等[3]培育的转基因小鼠可在其乳腺上皮细胞内表达OPN反义RNA, 此小鼠在妊娠期无乳腺腺泡发育, 分泌酪蛋白及乳清酸乳汁蛋白显著降低, 从而丧失泌乳能力.Cohen等[16]发现敲除OPN基因的小鼠乳腺分化和泌乳均表现不正常.哺乳期女性的乳腺上皮细胞与乳汁中亦可检测到OPN的高水平表达[17, 18].Tuck等[19]发现, OPN通过与细胞表面整合素的结合激活肝细胞生长因子(HGF)受体和表皮生长因子(EGF)及其受体, 增加蛋白水解酶的活性等多重效应, 促进人乳腺细胞的增殖与迁移, OPN表达的变化还涉及丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK) 、磷脂酶C(PLC)及蛋白激酶C(PKC)等.本实验的结果为揭示奶山羊乳腺组织的发育及其泌乳机制的研究提供了理论依据.但OPN蛋白影响乳腺上皮细胞增殖的原因, 涉及的相关生长因子和受体, 以及细胞信号传导的途径等具体机制尚需进一步研究.
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总结：该文是关于基因乳腺论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
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[3] 基因工程毕业论文题目大全 基因工程毕业论文题目怎么定
