简介:大学硕士与本科蛋白基因毕业论文开题报告范文和相关优秀学术职称论文参考文献资料下载，关于免费教你怎么写蛋白基因方面论文范文。
小麦糯性基因的多重PCR分子鉴定
卢龙斗1, 侯彩玲1, 陈龙2, 殷贵鸿3, 邓传良1, 高武军1, 杨绪勤1, 谭光轩2
1. 河南师范大学生命科学学院, 新乡453007,
2. 河南省周口师范学院生命科学系, 周口466000,
3. 河南省周口市农业科学院, 周口466001
摘 要: 采用多重 PCR 的方法, 对其反应条件进行优化, 以获得用于小麦糯性(Wx)基因分析的稳定PCR体系.应用两对引物, 分别扩增小麦 Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1 基因, 目的片段大小分别为: 230 bp/265 bp、854 bp和 204 bp.经反复验证, 结果准确可靠, 重复性好, 成本低, 可以在同一PCR反应体系中对 3 个Wx 基因进行同时筛选鉴定.该体系可用于 Wx 蛋白基因的分子标记辅助选择, 可以提高小麦淀粉品质评价和糯麦选育的效率.
关键词: 小麦, Wx基因, 多重PCR, 分子标记辅助选择
Molecular identification on Waxy genes in wheat using multiple-PCR
LU Long-Dou1, HOU Cai-Ling1, CHEN Long2, YIN Gui-Hong3, DENG Chuan-Liang1, GAO Wu-Jun1, YANG Xu-Qin1, TAN Guang-Xuan2
1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China,
2. Department of Life Science, Zhoukou Normal University, Henan Province Zhoukou 466000, China,
3. Zhoukou Institute of Agricultural Science, Henan Province Zhoukou 466001, China
Abstract: Multiple-PCR was conducted to establish a stable PCR system for identifying the three Wx genes in wheat. Two pairs of primers were employed to amplify Wx-A1, Wx-B1, and Wx-D1 genes of wheat, with the target sequences of 230 bp/265 bp, 854 bp, and 204 bp, respectively. The results showed that Wx-A1, Wx-B1, and Wx-D1 can be detected si-multaneously in a single reaction. This method proved to be repeatable and low cost for evaluation of wheat quality properties in breeding program. This multiple-PCR technique can be efficiently used in marker-assisted selection for Wx genes, which will improve selection procedure for waxy wheat.
Keywords: wheat, Wx gene, multiple-PCR, molecular marker-assisted selection
普通小麦(Triticum aestivum L.)中淀粉粒束缚态淀粉合成酶Ⅰ(Granules-bound starch synthaseⅠ, GBSSⅠ), 是淀粉合成过程中的关键酶, 又称蜡质蛋白或 Wx 蛋白, 含有 Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1 3个亚基, 分别由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1 3个基因编码[1, 2], 这3个基因分别位于7AS、4AL和7DS 染色体 上[3, 4].后来发现这3种Wx蛋白亚基均出现了缺失类型, 从而把野生型等位基因称为Wx-A1a、Wx-B1a和Wx-D1a.对应的缺失型等位基因称为Wx-A1b、Wx-B1b和Wx-D1b.Wx蛋白控制籽粒中直链淀粉的合成, 单个亚基或全部Wx蛋白的缺失均会影响小麦籽粒的直链淀粉含量.缺失一个或两个Wx蛋白亚基, 称为部分糯小麦, 3种Wx蛋白亚基全部缺失的小麦籽粒直链淀粉含量极低, 称为全糯小麦.
近年来, 随着育种学家对小麦淀粉合成相关基因遗传变异分子机制认识的不断深入, Wx蛋白的野生型及突变基因已被相继克隆[5~9], 特别是Murai 等[5]分离和识别了六倍体小麦的3个Wx基因, 以及Vrinten等[6]分析了这3个基因在DNA序列上的特点, 极大地促进了Wx基因分子标记技术的发展.目前, 国内外已开发了多种Wx基因的分子标记成功用于分子标记辅助育种[10~17], 但还有很多不足, 如部分标记为显性标记不能区分杂合体, 从而不能应用于高代的选择, 部分PCR扩增产物必须用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察等.Nakamura等[18]根据3个Wx基因的已知序列分别获得了Wx-A1和Wx-D1位点的共显性标记, 及Wx-B1位点的显性标记.他们还尝试了多重PCR反应, 利用毛细电泳同时检测Wx-B1和 Wx-D1位点的缺失, 为鉴定部分糯性小麦的Wx基因型提供了快速、简便的方法.Shariflou等[19]报道了能同时鉴定3个位点的PCR标记, 但Wx-B1位点仍是显性标记, 他们还得到一个与Wx-B1连锁的共显性SSR标记.张晓科等[20]利用三对引物建立了小麦糯性基因检测的多重PCR体系, 但仍存在条带模糊不清, 电泳难以分离等问题, 给分子标记辅助选择带来诸多不便.本研究利用已经报道Wx-A1、Wx-D1 基因的SSR[21]和Wx-B1基因的MAG267[22]特异分子标记, 通过摸索PCR反应组分和循环参数对多重 PCR反应结果的影响, 对已知基因型的品种进行检测, 并在Wx蛋白单向SDS-PAGE上进行了验证, 建立一次反应能够同时鉴定Wx-A1、Wx-D1和Wx-B1 基因的多重PCR反应体系, 旨在为Wx基因鉴定筛选提供快速高效的分子标记辅助选择方法, 从而提高小麦淀粉品质评价和糯小麦的选育效率.
1. 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料
供试小麦材料见表1.中国春(CS)、糯麦1902 由中国农大刘广田先生惠赠, 关东107、江苏白火麦由中国农科院殷贵鸿博士惠赠, 其余各品种均来自河南省周口市农科院.
遗传分析群体为矮抗58 × 糯麦1902的 F2 群体, 共 73 个单株.亲本矮抗58的 3 种Wx 蛋白均为野生型, 糯麦1902为糯小麦.
1.1.2 多重 PCR 所用的引物
本体系涉及 3 个基因的标记, 其引物序列和 PCR 预期扩增条带的大小列于表2.
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取
对照品种及群体各单株的DNA提取按CTAB法[23], 略有修改.
1.2.2 多重 PCR 扩增及电泳检测
25 L含1 × buffer (10 mmol/L Tris~HCl pH 8.3, 50 mmol/L KCl), 2.0 mmol/L MgCl2, 800 mol/L dNTP, SSR 引物为0.1 mol/L~0.11 mol/L, MAG267引物为0.1 mol/L~0.09 mol/L, 引物之比为1~1.22,模板DNA 200 ng, Taq DNA 论文范文酶 1 U.扩增参数: 95℃预变性3 min, 然后94℃变性1 min, 58℃复性 1 min, 72℃延伸1 min, 6个循环, 再进行94℃变性1 min, 58℃复性50 s, 72℃延伸30 s, 26个循环, 最后72℃延伸6 min. 电泳检测: 扩增产物中加入 2 L加样缓冲液, 取10 L在含有溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶上电泳分离, 缓冲体系为1×TAE溶液, 130 V电泳45 min, 紫外灯下观察并照相.为保证结果的稳定性和可靠性, 每份材料重复扩增3次以上.
1.2.3 Wx 蛋白单向 SDS-PAGE 检测
从半粒成熟小麦种子中提取Wx蛋白, 加入变性剂, 采用浓缩胶浓度4.5%, 分离胶浓度15%进行 SDS-PAGE 检测.参照姚大年等 [24]及王子宁等[25]实验方法, 略有改进.
2. 结果与分析
2.1 多重PCR检测结果分析
检测10个材料的结果显示(图1A): (1) 糯麦1902 和关东107 两个材料扩增出约 230 bp 的条带, 而其余 8 个材料扩增出了265 bp 的条带, (2)糯麦1902、关东107和豫麦47 三个品种未扩增出 854 bp 的条带, 而其余 7 个品种产生了 854 bp 的条带, (3) 糯麦1902和江苏白火麦两个材料未扩增出 204 bp 的条带, 而其余 8 个品种产生了 204 bp 的条带.
2.2 SDS-PAGE分析已知亚基组成的小麦品种的 Wx蛋白组成
以牛血清蛋白66.4 kDa为标准, 利用 SDS-PAGE 方法对已知基因型的中国春(CS)、糯麦1902、关东107、江苏白火麦、豫麦47、矮抗58、周麦18、周麦9823、新麦19和新麦208等10个品种进行了分析(图1B).结果显示: 对照品种中国春、矮抗58、周麦18、周麦9823、新麦19和新麦208 显示出62.8 kDa、58.7 kDa和56.7 kDa的3条蛋白带, 3个亚基均不缺失, 为野生型.糯麦1902没有任何Wx蛋白带, 缺失3个Wx蛋白亚基.关东107只显示 Wx-D1 蛋白带, 缺失Wx-A1和Wx-B1蛋白.江苏白火麦显示Wx-A1和Wx-B1蛋白带, 缺失Wx-D1蛋白.豫麦47显示Wx-A1和Wx-D1蛋白带, 缺Wx-B1蛋白.
2.3 多重PCR方法对F2分离群体的检测
用多重PCR体系对组合矮抗58 ×糯麦1902的 F2分离群体中的73株个体进行了筛选(部分结果见图2).得到了全部8种Wx基因型(表3), 野生型A_B_D_型56株, 单缺型aaB_D_ 3株、A_bbD_ 6株、A_B_dd 2株, 双缺型A_bbdd 2株、aaB_dd 2株、aabbD_ 1株, 全糯型aabbdd 1株.其中A_bbdd, aaB_dd和aabbdd 3种类型在自然界中不存在[12].这一结果与单引物检测及蛋白检测结果一致.
3. 讨 论
3.1 多重PCR检测方法的可行性
Wx-A1、Wx-D1基因的SSR标记在Wx-A1位点呈共显性[26], 在Wx-A1a和Wx-A1b位点分别扩增出 265 bp和约230 bp的特异性条带, 可以检测Wx-A1位点的纯合与杂合基因型.该标记在Wx-D1位点呈显性, 在Wx-D1a位点可扩出约204 bp的条带, 而在 Wx-D1b位点没有204 bp特异性条带的出现.Wx-B1 位点的标记MAG267是Wx-B1基因的显性标记[22], 在Wx-B1a位点能够扩增出854 bp的条带, 而在 Wx-B1b位点不能扩增出该条带.图1A 表明: 糯麦1902、关东107的Wx-A1位点为Wx-A1b等位基因,推测缺失Wx-A1蛋白亚基, 而其余8个材料在该位点为Wx-A1a等位基因, 推测含Wx-A1蛋白亚基, 糯麦1902、关东107、豫麦47的Wx-B1位点为Wx- B1b等位基因, 推测缺失Wx-B1蛋白亚基, 而其余7 个材料在该位点为Wx-B1a等位基因, 推测含Wx-B1蛋白亚基, 糯麦1902、江苏白火麦Wx-D1位点为 Wx- D1b等位基因, 推测缺失Wx-D1蛋白亚基, 相反, 其余8个材料被推断为含该蛋白亚基.
小麦种子胚乳Wx蛋白(平均分子量 60 kDa)可分为3个亚基: Wx-A1(62.8 kDa), Wx-D1(58.7 kDa)和Wx-B1(56.7 kDa)[27], 分别由Wx-A1、Wx-D1和 Wx-B1 3个基因编码, 基因为显性时, 可从电泳图谱上检测到该蛋白亚基, 基因缺失时, 电泳图谱上看
不到该蛋白亚基.图1B表明: 糯麦1902缺失3个 Wx 蛋白亚基, 关东107缺失Wx-A1和Wx-B1蛋白, 江苏白火麦缺失Wx-D1蛋白, 豫麦47缺失Wx-B1 蛋白.可以看出(图1:A, B), 在供试材料中, 由多重 PCR检测结果推断出的糯蛋白亚基组成与 SDS-PAGE电泳的结果是一致的.而且用本体系对矮抗58 ×糯麦1902 论文范文F2分离群体的检测结果也与单引物和蛋白鉴定的结果一致.说明本多重PCR体系是完全可行的.且经多次PCR验证结果稳定可靠, 可以用于在同一反应体系中对3个Wx基因进行同时筛选鉴定.
3.2 多重PCR检测方法的优势及缺点
本研究在常规PCR反应体系上, 利用Shariflou 等[21]设计的Wx-A1与Wx-D1位点和刘迎春等[22]设计的Wx-B1位点的引物组合, 构建了糯小麦多重PCR体系, 与Nakamura等[18]、Shariflou等[19]和张晓科等[20]开发的糯小麦多重PCR体系相比, 用的引物少, 扩增的条带数量减少, 条带之间的差异增大, 采用一般的琼脂糖凝胶和电泳仪就容易分辨扩增条带, 这表明本体系在小麦淀粉品质评价和糯麦选育中有很大的应用价值.但本体系涉及3个基因的标记, 只有Wx-A1位点的标记为共显性, 在分离后代鉴定中存在一定的局限性, 不能区分Wx-B1和Wx-D1位点是显性纯合还是杂合.事实上, 在本体系的构建过程中, 一开始选用刘迎春等[17]开发的Wx-D1 位点的共显性标记MAG269, 但经很多次重复扩增都未得到理想的效果.最近Nakamura等[28]已开发
出Wx-B1的共显性标记, 如能开发出3个Wx位点均为共显性标记的多重PCR的方法, 在育种实践中将具有更大的利用价值.
参考文献(References):
[1] Yamamori M, Nakamura T, Endo TR, Nagamine T. Waxy protein deficiency and chromosomal location of coding genes in common wheat. Theor Appl Genet, 1994, 89(23): 179–184.
[2] Yamamori M, Nakamura T, Kuroda A. Variations in the content of starch–granule bound protein among several Japanese cultivars of common wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica, 1992, 64(3): 215219.
[3] Nakamura T, Yamamori M. Hirano H, Hidaka S. Identifi-cation of three Wx proteins in wheat (Triticum aestivum L.). Biochem Genet, 1993, 31(12): 75–86.
[4] Yamamori M, Endo TR. Variation of starch granule proteins and chromosome mapping of their coding genes in common wheat. Theor Appl Genet, 1996, 93(12): 275–281.
[5] Murai J, Taira T, Ohta D. Isolation and characterization of the three Waxy genes encoding the granule-bound starch synthase in hexaploid wheat. Gene, 1999, 234(1): 71–79.
[6] Vrinten P, Nakamura T, Yamamori M. Molecular charac-terization of waxy mutations in wheat. Mol Gen Genet, 1999, 261(3): 463–471.
[7] Yan L, Bh论文范文e M, Fairclough R, Konik C, Rahman S, Appels R. The genes encoding granule-bound starch synthases at the waxy loci of the A, B, and D progenitors of common wheat. Genome, 2000, 43(2): 264–272.
[8] Yan L, Bh论文范文e M. Sequences of the waxy loci of wheat: utility in analysis of waxy proteins and developing molecular markers. Biochem Genet, 2000, 38(1112): 391–411.
[9] Monari AM, Simeone MC, Urbano M, Margiotta B, Lafiandra D. Molecular characterization of new waxy mutants identified in bread and durum wheat. Theor Appl Genet, 2005, 110(8): 1481–1489.
[10] Shariflou MR, Hassani ME, Sharp PJ. A PCR-based DNA marker for detection of mutant and normal alleles of the Wx-D1 gene of wheat. Plant Breed, 2001, 120(2): 121–124.
基因睾蛋白论文范文:华肝基因 基因蛋白的故乡1
[11] Mclauchlan A, Ogbonnaya FC, Hollingsworth B, Carter M, Gale KR , Henry RJ, Holton TA, Morell MK, Rampling LR, Sharp PJ, Shariflon MR, Jones MGK, Appels R. Development of robust PCR-based DNA markers for each homoeo-allele of granule-bound starch synthase and their application in wheat breeding programs. Aust J Agric Res, 2001, 52(12): 1409–1416.
[12] 梁荣奇, 张义荣, 刘守斌, 李保云, 谷 丹, 唐朝晖, 刘广田. 利用Wx基因分子标记辅助选择培育糯性小麦. 遗传学报, 2001, 28(9): 856–863.
[13] 梁荣奇, 张义荣, 姚大年, 李保云, 尤明山, 刘广田. 小麦淀粉品质改良的综合标记辅助选择体系的建立. 中国农业科学, 2002, 35(3): 245–249.
[14] 梁荣奇, 张义荣, 唐朝晖, 刘守斌, 李保云, 尤明山, 刘广田. 利用Wx基因分子标记辅助选择培育面条专用优质小麦. 农业生物技术学报, 2001, 9(3): 269–273.
[15] 宋建民, 李保云, 尤明山, 梁荣奇, 常成, 刘守斌, 唐朝晖, 刘广田. 小麦淀粉粒束缚淀粉合成酶基因多态性的分子鉴定. 遗传学报, 2004, 31(1): 81–86.
[16] 任丽娟, 蔡士宾, 马鸿翔, 张旭, 周淼平. 用一个SSR标记快速检测小麦论文范文后代Waxy基因型. 麦类作物学报, 2004, 24(3): 9–12.
[17] 刘迎春, 朱惠兰, 程顺和, 马正强. 小麦Wx-A1和Wx-D1位点的PCR分子标记. 麦类作物学报, 2005, 25(1): 1–5.
[18] Nakamura T, Vrinten P, Saito M, Konda M. Rapid classi-fication of partial waxy wheats using PCR-based markers. Genome, 2002, 45(6): 1150–1156.
[19] Shariflou MR, Hassani ME, Good G, Sharp PJ. Tightly linked DNA markers for the waxy loci in bread wheat. Tenth International Wheat Genetics Symposium, 2003, 2: 831–834.
[20] 张晓科, 夏先春, 王忠伟, 万映秀, 张平治, 何心尧, 杨燕, 何中虎. 小麦品质性状分子标记多重PCR体系的建立. 作物学报, 2007, 33(10): 1703–1710.
[21] Shariflou MR, Sharp PJ. A polymorphic microsatellite in the 3&,apos, end of ‘waxy’ genes of wheat, Triticum aestivm. Plant Breed, 1999, 118(3): 275–277.
[22] 刘迎春. 小麦Wx基因的分子标记及其应用[学位论文]. 南京农业大学, 2004.
[23] Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW. Ribosomal DNA spacer length polymorphi论文范文s in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(24): 8014–8018.
[24] 姚大年, 王新望, 刘志勇, 刘广田. 小麦品种Waxy蛋白的鉴定和筛选. 农业生物技术学报, 1999, 7(1): 1–9.
[25] 王子宁, 郭北海, 李洪杰, 张艳敏, 温之雨. 多倍体麦类作物Wx蛋白检测的SDS-PAGE方法. 遗传, 2000, 22(3): 169–171.
[26] 余春梅, 陈佩度. 普通小麦(T. aestivum L.) Waxy蛋白种质资源研究. 南京农业大学学报, 2003, 26(3): 1–6.
[27] Zhao XC, Sharp PJ. An improved 1D-SDS-PAGE method for the identification of three bread wheat ‘waxy’ proteins, J Cereal Sci, 1996, 23(2): 191–193.
[28] Saito M, Vrinten P, Ishikawa G, Graybosch R, Nakamura T. A novel codominant marker for selection of the null Wx-B1 allele in wheat breeding programs. Mol Breed, 2009, 23: 209–217.
总结：本论文主要论述了蛋白基因论文范文相关的参考文献,对您的论文写作有参考作用。
基因睾蛋白多少钱引用文献:
[1] 基因工程毕业论文题目大全 基因工程毕业论文题目怎么定
[2] 基因工程应用专业论文选题 基因工程应用论文题目选什么比较好
[3] 优秀生物基因工程论文选题 生物基因工程论文题目选什么比较好
