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1A型糖尿病预防的分子生物学机制

主题:胰岛素 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-02-07

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糖尿病胰岛素论文范文

胰岛素论文

目录

  1. 胰岛素:胰岛素,糖尿病胰岛素,预防最重要—名医讲糖

乔治

大部分但并非所有的1型糖尿病患者表现免疫介导的疾病形式,即T细胞介导的特异性p细胞破坏而致的1A型糖尿病.对NOD鼠模型的相关研究显示,l型糖尿病发病的根本原因涉及种系编码序列,由其形成的三分子复合物构成胰岛素肽段B: 9-23,此肽段由主要组织相容性复合物II(MHC)的I-Ag7分子提呈,且能被具有特异性α链序列的T细胞受体识别.利用遗传学检查、自身抗体检测及测量代谢性指标,现已能够预测1A型糖尿病的发生.免疫治疗可延迟β细胞破坏,但尚不能彻底预防β细胞破坏的发生.随发病率的增加,估计约有100万美国人患有或将发生1A型糖尿病,因此预防1A型糖尿病已成为重要的国际目标.为达此目标,需对现在尚处试验阶段的免疫疗法进行不断改善,以及进一步了解l型糖尿病发病机理中自身免疫性三分子复合物的作用.

1A型糖尿病患者既面临着严重的糖尿病慢性并发症,亦需面临酮症酸中毒、低血糖状态等危及生命的急性并发症.人们不断研究尝试多种治疗途径,试图治愈疾病或至少显著减轻LA型糖尿病给患者及其家属带来的沉重负担.由于可提供血糖“实时”信息,对低血糖或明显高血糖进行及时预警,持续血糖监测已改善了众多1型糖尿病患者的生活质量.数个研究小组正致力于研究闭环胰岛素泵,在发达国家,此类“智能”胰岛素泵很有希望迅速成为胰岛素依赖型糖尿病患者的标准治疗.此外,胰腺移植(长期)及胰岛移植(短期)可治愈1型糖尿病,但对于大多数病人而言,此类移植的免疫抑制治疗相关风险不可接受.除异体免疫外,自身免疫也可能限制上述移植治疗的效果.

1型糖尿病免疫相关领域发展迅速,相关出版物已有上千篇,本综述重点关注的是一个相对简单的假设,即自身免疫性l型糖尿病是慢性T细胞效应所致特异性β细胞破坏的结果,而这种靶向效应的主要分子决定因子固定于基因组内.

尽管存在明显的表型差异,在分子水平上NOD鼠与l型糖尿病患者间存在惊人的相似.本文将首先探讨NOD鼠的疾病发病机制(相对易于证误),而后讨论1型糖尿病患者的发病机制,最后对相关临床试验的进展情况进行总结.我们相信NOD鼠l型糖尿病的根本病因是基因组的三个编码·序列,如图l所示.我们认为相关的序列是:胰岛素肽段B: 9-23序列;易感MHC I-Ag7序列;T细胞受体(TCR)特异性Va序列.

自身免疫性三分子复合物

B:9-23胰岛素肽段

NOD鼠糖尿病发生必需的三分子复合物的第一个组分是胰岛素的一段肽段,即氨基酸9-23.越来越多的证据显示,针对胰岛素的自身免疫反应是NOD鼠1A型糖尿病发病机制的中心.Daniel等成功克隆来自NOD鼠胰岛的T细胞,他们的实验成果对于确定作用于胰岛素的T细胞在1A型糖尿病发病过程中发挥作用极其重要.他们发现绝大多数CD4 T细胞克隆起源于对胰岛素有反应的胰岛,且在那些对胰岛素有反应的胰岛中,由B: 9-23肽段刺激者超过90%.这些T细胞克隆能够加速NOD鼠的糖尿病发展,其中一些亚群还能在免疫缺乏小鼠中诱导糖尿病.T细胞克隆及针对胰岛自身抗体的转基因TCR能够导致或预防糖尿病.在本文中,尽管我们着重讨论的是CD4 T细胞,但CD8T细胞,包括作用于胰岛素B15-23序列的T细胞,同样具有非常重要的作用.II类等位基因(可能为CD4 T细胞)在决定人类及动物模型患糖尿病的风险方面起决定作用.

鼠类有两个胰岛素基因.去除胰岛素基因1可在90%的NOD鼠中预防糖尿病的发生;去除胰岛素基因2则急剧加速糖尿病的发展.两个胰岛素基因在胰岛均有表达,但胸腺仅有胰岛素基因2表达.胸腺上皮细胞分泌的小剂量胰岛素诱导的免疫耐受效应或许是NOD鼠胰岛素基因敲除细胞株具不同表型的原因.然而,删除其他自身抗原基因如GAD65,IGRP,IA-2,IA-2beta等,并不会改变NOD鼠糖尿病进程.

为了测试以胰岛素为靶向目标是否为糖尿病发展所必须,我们联合敲除胰岛素基因l及胰岛素基因2.为预防代谢性糖尿病在双重胰岛素基因敲除者中的发生,我们将一个具有变异胰岛素B: 9-23肽段的前胰岛素基因转入受试对象.之所以选择这种特殊的变异,是因为Daniel等培养的抗B:9-23T细胞克隆不是由这种突变肽段刺激而来.仅有变异胰岛素基因的NOD鼠不发生糖尿病,不表达胰岛素自身抗体,亦不发生胰岛炎,虽然针对胰岛自身反应及胰岛炎症反应的保护作用并不完全.通过移植具正常胰岛素基因序列的胰岛、以天然B: 9-23肽段免疫、或转导天然胰岛素基因替代缺乏的天然胰岛素基因序列可恢复胰岛素自身抗体的生成.这些后续研究性质复杂,因为虽然移植的胰岛具有天然胰岛素基因,但胰腺内源性胰岛并不具备此类基因.为了证明将表达天然B: 9--23基因的胰岛移植至双重基因敲除的小鼠可诱导糖尿病的发生,研究者将小鼠胰岛细胞转输入一只胰岛表达天然B: 9-23基因的免疫缺乏小鼠.引人注意的是,被移植至肾被膜下方的表达天然B: 9-23基因序列的胰岛在4周后诱导了胰岛素自身抗体生成,说明特异解剖学位置(例如胰腺)或胰岛素B: 9-23肽段的表达皆非糖尿病发展所必需.

胰岛素:胰岛素,糖尿病胰岛素,预防最重要—名医讲糖

考虑到NOD鼠T细胞可识别的胰岛自身抗体数量,抗原识别等级成为重要问题.许多研究者证明诱导对胰岛素“隐性”免疫耐受的技术可预防糖尿病.Krishnamurthy等的近期研究揭示,对胰岛素的免疫反应是对主要胰岛自身抗原IGRP的免疫反应的“上游”效应.值得注意的是,尽管IGRP CD8反应性T细胞在NOD鼠模型中作用突出,为诱导胰岛素耐受而引进的具I-E-启动子驱动的胰岛素原的小鼠不生成IGRP反应性T细胞.即使是IGRP为靶目标的、对胰岛素反应被阻断的TCR转基因小鼠,也并不自行发生糖尿病.因此,对于IGRP的免疫反应是针对胰岛素原的免疫反应的下游效应,且并非糖尿病病程进展所必需.现阶段尚无法回答,针对除胰岛素之外的所有胰岛自身抗原的反应是否为疾病进展所必需,因为数种重要的自身反应性T细胞克隆的目标抗原未知,或尚未在NOD鼠中进行相关基因敲除实验. (例如chromagranin,BDC2.5T细胞的靶抗原)

基因敲除实验说明特异性胰岛自身抗原无关键作用,但这并不能排除这些自身抗原在分子间表位扩散后具有重要作用的可能性.检测此类自身抗原或针对此类自身抗原的T细胞反应可能对糖尿病预测有重要意义,且用此类抗原进行免疫治疗可能能够诱导显性免疫耐受.一旦NOD鼠已发生糖尿病,仅具有B16:A突变的胰岛素基因序列的胰岛移植物迅速被破坏.这说明一旦自身免疫反应开始,针对非胰岛素分子的抗胰岛自免反应已足够破坏胰岛,或者在移植物所处环境中对B16:A序列的识别改变了抗原表位,这足以导致β细胞被破坏.值得注意的是,与移植胰岛不同,具变异B16:A序列的胰腺内胰岛能够抵抗从致病性NOD鼠获得的细胞转移所致破坏.这说明在存在抗原表位扩散的情况下,虽然无法起到完全的保护性作用,B: 9-23基因序列的缺乏仍具重要作用.

至今为止,基因敲除试验只能通过敲除胰岛素基因以影响糖尿病的发展.与之不同,众多的胰岛自身抗原及其相关多肽能被用于多种途径来预防NOD鼠的糖尿病进展.这些对糖尿病的显著抑制作用通常是通过提高调节性T细胞功能而达到的.有证据表明,调节性CD4,CD8甚至B淋巴细胞在影响糖尿病发展中发挥作用.通过鼻腔给药或皮论文范文射(特别是以完全弗氏佐剂为溶液)胰岛素B:9-23肽段,可预防糖尿病.值得注意的是,皮论文范文射胰岛素B: 9-23肽段可能通过激活CD4 T细胞诱导胰岛素自身抗体生成,这些抗体结合于胰岛素而非免疫性肽段.即使是正常的Balb/c小鼠对胰岛素B: 9-23肽段亦产生上述反应.在有合适的II类分子(如,NOD鼠的I-Ag7或Balb/c鼠的I-Ad,二者具有相同的I-Aα链序列)存在的情况下,肽段诱导胰岛素自身抗体产生,其机制可能是抗B: 9-23 CD4T细胞被活化.虽然胰岛自身抗体被诱导生成,除非固有免疫系统被激活(例如,通过注射多聚-IC),否则不会产生胰岛炎.

l-Ag7

鼠类动物的CD4 T细胞的TCR可识别表达于II类抗原提呈分子家族的I-E及I-A分子表面沟槽内的目标肽段,而CD8 T细胞可识别表达于I类抗原提呈分子家族的K、D分子表面沟槽内的目标肽段.人类中相应的分子是DQ(对应I-A)、DR(对应I-E)、HLA-A,-B,-C(对应K、D).上述抗原提呈分子具有高度多态性.围绕沟槽的氨基酸序列与肽段结合,从而决定免疫反应的靶向目标.在人类及1型糖尿病的鼠类模型中,II类分子对于NOD鼠糖尿病发生起着重要作用.基因效应非常巨大,仅8只糖尿病小鼠即可证明.这些糖尿病小鼠均具有纯合的NOD特异性主要组织相容性区域(表达I- Ag7不表I-E),这8只小鼠为NOD鼠和正常对照小鼠的杂交后代.II类分子可能通过改变TCR谱以及提高T细胞识别特异性肽段的能力而发挥作用.特殊的是,I-Ag分子及人类DR4相关DQ8分子、DR3相关DQ2分子均具有特别的结合袋9,这种结构缺乏天冬氨酸.相关假设推测,这种天冬氨酸的缺乏有利于自身抗原性肽段的呈递,此类肽段具剩余电荷,能够与特殊的结合袋9结构相结合.然而,近期与Kappler实验室合作的研究有相反发现,即为致病性TCR识别的B: 9-23肽段在另一个低亲和力区识别肽段.胰岛素在鼠类及人类的胸腺由特殊胸腺上皮细胞产生,且能导致胰岛素反应性T细胞的清除.可能胸腺内具有以B: 9-23为靶向目标的TCR的T细胞很少在低亲和力区遭遇肽段,故得以逃避中枢(如胸腺)免疫删除.这些逃避了中枢免疫删除的T细胞随后在胰腺内极高胰岛素浓度环境下,即可破坏胰岛β细胞.

具有TR论文范文5D-4*04α链片段的TCR

三分子复合物的第三个组分是由α链及β链组,成的TCR.由基因片段的随机选择及重组,形成了数十亿种独特的TCR.TCR的最终构象类似具6个指状结构(互补决定域/CDR)的长管,其中三个CDR由α链提供,其余三个CDR由β链提供.正是这些指状结构与MHC多肽结合,继之活化具TCR的T细胞.经典的对目标肽段的识别通常需要所有CDR共同参与,其中,CDR3-般占主导地位.CDR1与CDR2由基因组编码,同时具有Va和VβTCR片段.与之不同,CDR3的α链由随机结合的Va及Ja基因片段的交界处编码,其p链由V,D,J的交界处编码.此外,结合并不精确,可能出现核苷酸的增加或丢失,引起CDR3序列的变异.

考虑到I-Ag7的独特性及B: 9-23肽段与自身免疫性糖尿病发病相关,或许,NOD鼠的抗B:9 23肽段TCR可能具有异常.对Wegmann等发现的TCR克隆来源的TCR进行测序,结果显示其中大部分具有特异性的V论文范文段,该片段被称为TR论文范文5D-4*04(注:每一种独特的V论文范文段都被赋予相应的数字编号).意外的是,CDR3的N端及TCRβ链不具保守性.故我们认为,如果我们建造小鼠模型,使其表达保守的Va链,同时不限制其β链,允许其形成多种不同的β链,则可能诱导胰岛自身免疫反应的发生.通过采用Vignali等发明的技术,我们建立了具多种不同Oc链序列(包括TR论文范文5D-4*04)的转基因及逆基因小鼠模型.绝大部分的小鼠体内产生了胰岛素自身抗体,其中的部分小鼠发生了糖尿病.通过从此类小鼠获得融合TCR,我们估计每100个具包含抗B: 9-23a链的TR论文范文5D-4*04片段的TCR中有1个与B: 9-23发生反应.

以胰岛素为目标的三分子复合物中的两个组分为多种(TR论文范文5D α链,字列)或所有(胰岛素B:9-23序列)鼠类品系共有.换而言之,具I-Ag7是NOD鼠的一种独特属性.其他与维持免疫耐受状态或环境因素(或缺乏保护性环境因素如特定病毒感染)有关的遗传多态性影响自身免疫的激活.考虑到能以B: 9-23肽段为目标的T细胞数目可能极大,我们认为NOD鼠p细胞与免疫系统间的互相作用与蜂群相似.一旦免疫耐受状态被打破,众多共享TCR的共同特征T细胞处于以胰岛素为目标的预备状态中.

上述假设尚未接受一系列关键的测试.例如,一个重要的预测是:敲除TR论文范文-5D-4*04基因片段可预防糖尿病及胰岛素自身抗体产生,类似于B: 9-23胰岛素肽段突变的效果.除了在基因方面反驳共有的Va序列非常关键的假设,人们也在积极探索能特异性阻断上述三分子复合物的治疗手段.

我们正通过两种途径对以NOD鼠三分子复合物为目标的治疗进行研究.Ostrov利用DOCKING程序对NCI图书馆内为药物实验设计的140,000个候选分子进行筛选,从而确定了一系列小分子.我们与他合作,确定了能够调节抗B: 9-23TCR信号的小分子(A Michels,数据尚未发表).我们认为与I-Ag7的特殊袋状结构结合的小分子家族既能增强亦能抑制TCR对于B: 9-23肽段的反应,还可以改变NOD鼠中占主导地位的TR论文范文5D4*04B:9-23T细胞的特异性细胞因子反应.

此外,我们发现相关证据,证明识别B: 9-23肽段的抗体在I-Ag7的沟槽结构结合,能够阻止体外实验中B: 9-23肽段的表达(L Zhang,数据尚未发表).在此基础上,诱导此类具疾病预防能力的抗体生成的实验即将进行.人类1型糖尿病的阶段划分

1986年,我们建立了一个1A型糖尿病的慢性自身免疫发展过程的模型,将疾病的发病机理划分为一系列的阶段(图2).至今仍无相关技术能够直接评定β细胞量,因此,关于复发一缓解疾病进程是否与β细胞破坏有关以及一些患者的β细胞破坏是否是急性过程的讨论一直存在.在上述模型中,考虑到不同个体异质性,图2的X轴没有强调精确的时点.不同个体以不同速度向显性糖尿病进展,同卯双生子之一发生糖尿病与其同胞出现胰岛自身抗体之间的时间可以相差数十年.通过多个研究及疾病预防实验,我们发现有可能预测1A型糖尿病的发生,这个可能性在此模型中得到强调.

第1阶段遗传易感性

尽管1A型糖尿病通常受多基因遗传影响,有两种十分罕见的与糖尿病相关的自身免疫反应综合征属于“单基因”遗传范畴:APS-1(1型自身免疫性多内分泌腺病综合征),IPEX综合征(免疫失调,多内分泌病变,肠下垂,X连锁).

IPEX综合征由FoxP3基因突变引起,此转录因子对调节性T细胞发展起重要作用.缺乏FoxP3的患儿将发生超强的自身免疫反应,且约80%患儿会发生l型糖尿病.糖尿病症状可在患儿出生后数天内即显现.此综合征充分证明了调节性T细胞的重要性,除非致病性T细胞受到控制,否则大多数人都可能发生l型糖尿病.对于被诊断为此种致命性自身免疫综合征的患儿,可考虑进行骨髓移植,以提供调节性T细胞.另一种正在探索中的可能疗法是培养表达FoxP3、具调节能力的抗原特异性T细胞株.

APS-1较IPEX综合征常见,且在少数种群(如伊朗人群、犹太人群)中发病率稍高,但总体来说仍十分罕见.APS-1的特征是粘膜念珠菌病、Addison氏病及论文范文功能低下,其病因为AIRE(自身免疫反应调节者)基因突变.此病通常以常染色体隐性方式遗传,然而亦有一个存在显性突变的家族被报导,且两种遗传方式的动物模型均已建立.AIRE基因对于增强如胰岛素等外周抗原在胸腺髓质上皮细胞内的表达起重要作用.少量“外周”(如胸腺外)抗原如胰岛素及胸腺内表达的抗原与自身反应性T细胞的阴性选择及避免自身免疫反应有关.APS-1患者逐渐发生一系列自身免疫失调,且比特定疾病表达更多的自身抗体.值得注意的是,据报导,所有APS-1患者均具有针对干扰素α的自身抗体.约18%的APS-1患者发生l型糖尿病,其糖尿病的发展受保护性HLA等位基因DQBl*0602及胰岛素基因多态性的影响.

总之,上述两种综合征是自身免疫性糖尿病遗传因素起决定作用的极端例子,证明一个或两个维持免疫耐受状态所必需的通路被打破将导致疾病的发生.当控制免疫耐受的基因突变程度超过维持避免自身免疫反应发生的正常多基因状态时,人们易于发生1型糖尿病.

APS-2综合征较APS-1综合征更常见.APS-2综合征的临床特征是同一个体发生多种自身免疫失调(如1A型糖尿病,Addison氏病,甲状腺炎,腹腔疾病等).它复杂的遗传机制类似1A型糖尿病,但与之不完全相同.特别是,Addison氏病的最高危HLA基因型(DR3/4-D02/8)为DRBl*0404而非DRBl*0401或DQBl*0302.患1A型糖尿病的病人发生APS-2的一系列自身免疫失调的可能性增加,特别是Addison氏病、腹腔疾病、甲状腺自身免疫反应以及恶性贫血.我们通过一系列测试对l型糖尿病患者进行常规筛查,目的是排除相关联的针对肾上腺、小肠、甲状腺的自身免疫反应,这些检查包括:通过检测2 1羟化酶抗体检查Addison氏病(阳性率1.5%),通过检测转谷氨酰胺酶抗体检查腹腔疾病(阳性率10%),通过检测TSH检查甲状腺疾病.在诊断为1型糖尿病1年内,约三分之一的病人已经有一种或多种针对其他靶器官的自身抗体表达.

1A型糖尿病已经成为研究的最透彻的复杂遗传性疾病之一.大约每300个美国公民中有1人患有1A型糖尿病,而约每20个糖尿病患者*亲属中就有1人患1A型糖尿病.我们还观察到,父亲为l型糖尿病患者的兄弟姊妹及后代患l型糖尿病的风险高于母亲为l型糖尿病患者的后代.经过长期随访发现,大多数l型糖尿病患者的同卵双生子发生胰岛自身免疫反应(>,70%)与糖尿病(>,60%).同卵双生子的两人发生糖尿病的时间可相差30年.然而,异卵双生子发生糖尿病的风险与兄弟姊妹没有区别,约为5%.

如上所述,尽管存在很强的遗传倾向,绝大多数(>,90%)lA型糖尿病患者不具有患糖尿病的一级亲属.虽然40%丹佛市人群携带高危HLA等位基因DR3或DR4,其中仅有2.4%的人口携带最高危基因型,即DR3与DR4,且这种杂合子个体占青少年糖尿病患者的30%.因此,在总人群中易感等位基因携带率较高的情况下,从父母双亲遗传得来HLA基因型对于l型糖尿病的发展非常重要.

与NOD鼠模型相似,1A型糖尿病的主要基因决定因素是II类MHC基因DQ、DR和DP(依此顺序)的多态性.最高危基因表型由1个DRBl*0301-DQAl*0501-DQBl*0201单倍体型和另一个DR4单倍体型(DRBl*0401-DQAl*0301-DQBl*0302,简记为DR3/4-DQ2/8)构成.约30%~50%患1A型糖尿病的患儿携带这种基因表型(注:患者发病年龄越轻,携带此基因表型的可能性越大).在总人群中携带此基因表型者患1A型糖尿病的绝对风险约为5%.DRBl*0403等位基因降低DR4单倍体型携带者的患病风险,一些DP等位基因也能改变风险(如DPBl*0402).此外,有数种HLA等位基因具有极强的保护作用.DQBl*0602的保护作用尤其明显,总人口中约20%携带此等位基因,但仅1%的1A型糖尿病患者携带该等位基因.

由Marian等牵头的DAISY研究,测试了科罗拉多州丹佛市超过30,000名新生儿的HLA表型,继之对总体中超过l,000名携带HLA高危基因的患儿及1,000名HLA无关的一级亲属进行随访.1型糖尿病患者的同胞患病率是患者后代的数倍,尽管患者的同胞及后代均有与先证者相同的一半基因组.可能有多个遗传及环境因素共同造成同胞患病率较高,但最简单的解释是MHC内基因表现其他多态性而增加特定单倍体型的风险.携带两个与先证者同胞相同的HLA单倍体型的DR3/4-DQ2/8同胞,与只携带一个/或不携带与先证者同胞相同的HLA单倍体型的DR3/4-D02/8同胞相比,具有极高的糖尿病患病风险.这一现象说明了上述解释的可能性.DAISY研究中此类同胞的胰岛自身免疫反应被激活的风险高达70%,且此类同胞占了DAISY研究中所有进展为胰岛自身免疫及稍后的糖尿病状态患儿中的大部分.在DAISY研究中,通过对DR,DQ及DP的分型,可确定总人群中约有20%的高危人群.然而,占总人口约20%的DR3/DR4杂合子个体的患病风险远低于约占70%的与先证者具相同DR3/4表型的个体,这意味着MHC中尚存额外的基因多态性有待发掘.我们找到相关证据表明其中一个位点位于MHC端粒酶端,且特定的HLA I类等位基因与此风险有关,特别是表达于2%~4%患者中的HLA-B39.另外,HLA-A24与早发性1A型糖尿病相关.值得注意的是,HLAB39的表达可增加DR8单倍体型的患病风险.

考虑到MHC数百万的碱基对的多个几乎完全保守的单倍体型(其中两个最为大家熟知的保守单倍体型为HLA-A1,B8,DR3单体型及HLA-A30,B18,DR3“Basque”单体型),寻找MHC中的那些非HLA疾病决定因子十分困难.“Basque”单体型较Al,BB,DR3单体型风险更高,尽管两种单体型的DR和DQ等位基因序列相同.考虑到两种单体型均具DR3,二者的糖尿病罹患风险均升高.

因为一些特定的HLA等位基因可提供巨大的保护作用,人们开始考虑是否此类等位基因能够运用于糖尿病治疗或家庭计划中.这些具保护作用且决定患病风险的等位基因可能是决定以哪些特定自身分子结构为靶向的“正常”HLA等位基因.例如,对1A型糖尿病具保护作用的DR2DQBl*0602单倍体型是多发性硬化的最高危单体型.

人们现已在识别与遗传风险有关的非MHC位点方面取得了较大进展,超过40个位点已得以确认.但多数此类遗传位点的优势比(OR值)小于1.2(注:OR值为1.0意味无风险,MHC的OR值>,6),其总和影响远小于MHC对糖尿病的影响.继MHC之后,下一个最重要的位点是胰岛素基因.胰岛素基因一个序列的5’端的保护性多态性增加胸腺胰岛素的表达,降低糖尿病风险,而这可能是通过增加胸腺内对以胰岛素为靶向目标的T细胞的删除实现的.

PTPN22基因是第三个重要的基因位点.一个氨基酸(R640W)的改变即可增加糖尿病的发病风险,其OR值约为2.PTPN22基因编码的分子(lyp)是一种淋巴细胞特异性酪氨酸磷酸化酶,与疾病相关的多态性增加对TCR信号通路的抑制,可能是通过功能获得机制实现.这种功能获得究竟如何影响糖尿病发病风险尚不清楚,但主流假设是它可以减少胸腺内T细胞的阴性选择.另外,亦有许多特定的基因包括CTLA4、CCR5、IL2受体及许多包含一个或多个潜在相关基因的位点被发现.一种与干扰素信号通路相关的解旋酶(IFIhl)有几个少见的变异,这些变异与患病风险相关,也与单核苷酸多态性相关.似乎所有已确认的位点均通过作用于免疫系统而影响糖尿病患病风险.有趣的是,与2型糖尿病相关的基因多态性基本对l型糖尿病的发展无影响,尽管也有报导称TCF7L2基因多态性与成人隐匿性自身免疫性糖尿病相关联.总的来说,1A型糖尿病与2型糖尿病的遗传学机制可能不同,1A型糖尿病主要是一种免疫介导的疾病.

关于与1型糖尿病风险相关的罕见基因变异的研究几乎还未起步,但可能存在多个这样的变异.此外,MHC的单个或多个位点尚有待研究,其中的一些位点可能能够调节疾病风险,且其调节能力可能远超已发现的MHC外的共同变异的调节作用.多个共同通路引起对l型糖尿病的易感性,包括以多肽抗原(I类和II类HLA)为靶向的T细胞;以胰岛素原/胰岛素为靶向的T细胞,特别是TCR信号通路(例如PTPN22,CTLA4);免疫耐受机制维持(例如,foxP3、AIRE)以及新生儿免疫反应(例如IFIhl).现在已经可以识别与已知HLA基因型/单体型相关的1A型糖尿病的高危或极高危个体,此外,胰岛素位点及PTPN22对识别糖尿病高危个体亦有一定帮助.OR值小于1.2的位点的SNPs对于遗传学预测无帮助,但很可能有助于阐明重要的发病机制.虽然可以通过HLA分析(如DR3/4杂合子)识别极高危个体,但他们仅构成不到一半的1A型糖尿病患者,且近50年来存在着DR3/4携带者中糖尿病患者比例下降的趋势.应对总体人群中的高危个体进行与l型糖尿病患者家属类似的预防性测试.这样,如果将基凶筛查与胰岛自身抗体检查相结合,有可能在糖尿病初发时即预防其发病、降低死亡率.

第2阶段:环境触发

过去的20年间,我们获得的关于环境因素对l型糖尿病影响的相关认识甚少.尽管如此,过去20年间西方国家1型糖尿病发病率成倍增长的事实,清楚的说明了环境方面的决定因素十分重要.发病率的增长速度如此之快,单纯以人群基因变异已无法解释.为此提出的一个重要假设是“卫生学”假设,即感染性疾病的减少导致多种免疫性疾病发病增加,包括哮喘和糖尿病.据报道,若将NOD鼠与BB鼠于无菌环境中饲养,其糖尿病发病情况发生改变.近期研究亦指出动物模型中的小肠内微生物群可调节糖尿病的发展.另一个假设提出,胰岛素抵抗从某种程度上加速l型和2型糖尿病的发展速度,且尽管二者的MHC存在区别,但l型和2型糖尿病有相似的遗传学病因.虽然与肥胖相关的胰岛素抵抗可能通过降低胰岛素分泌影响l型糖尿病进展,但近期的遗传学分析不支持卜述“卫生学”假说.

值得注意的是,一些药物能诱导1A型糖尿病的发展.尤其值得注意的是,干扰素治疗与动物模型中糖尿病发生相关,而对于人类,干扰素治疗能诱发胰岛素自身抗体产生、加速糖尿病进展、导致酮症酸中毒.甲巯咪唑、青霉胺和硫辛酸(如含巯基药物)能诱导自身抗体生成,且有时抗体滴度很高,足以对代谢产生影响(例如,胰岛素自身免疫综合征:与DR Bl*0406相关的Hirata病).

其他可能的环境影响因子包括饮食凶素,有报道称牛奶、早期引入谷类食物、ω-3脂肪酸水平降低及维生素D水平降低均影响糖尿病患病风险.目前,大规模实验及前瞻性研究可以对这些假设进行严格的检测.值得注意的是,代谢物组学及mRNA序列分析现均被用于识别抗胰岛自身抗体出现前可能的异常状态.因为此类方法需要分析多个参数指标,同时检测上千个可能的指标,故可能产生许多假阳性结果,使重复性试验变得至关重要.这既是此方法的优势,同时又是潜在的缺点.

在发现1A型糖尿病为慢性免疫性疾病之前,有许多关于病毒感染诱导糖尿病的研究.因此,研究者们在患者糖尿病发病时寻找病毒感染的证据,包括研究糖尿病发病时死亡患者的胰腺.其中,研究最多的是先天性风疹病毒感染及肠道病毒感染,虽然现在尚无法确定其重要性.主要的困难是在糖尿病发生数年前诱导胰岛自身免疫反应,以及触发胰岛自身免疫的病毒可能有多种、普遍存在于体内、在短时间内发挥作用.上述认识均来自于小鼠模型的病毒诱导的自身免疫性糖尿病的相关研究.

通过研究糖尿病抵抗性BB鼠模型,发现感染KRV可诱导糖尿病,人们获得了1A型糖尿病的最佳动物模型.抗糖尿病性BB鼠作为正常对照鼠类而被培养,它们缺乏BB鼠类原始品系的淋巴细胞减少症,而正是BB鼠的这一特征使其自发性发生糖尿病.一部分BB-DR鼠自发性发生糖尿病,随后的研究发现这些小鼠被KRV病毒感染,于是人们发现KRV感染可诱导糖尿病发生.现在我们知道,多个具有相同II类MHC等位基因(如RTl-U)及特定TCR位点的的鼠类品系,在被数种不同病毒感染或以包括Toll样受体(TLR)激动剂的免疫诱导剂刺激时,均可发生糖尿病(以不同疾病发展速度).多聚IC是一种病毒RNA模拟物,也是TLR3的激动剂,给予在胰岛p细胞表面表达B7分子的鼠类多聚IC,小鼠也发生糖尿病.在这个模型中,多聚IC诱导干扰素Oc生成.抗干扰素α的抗体阻断糖尿病发展,而干扰素本身诱导糖尿病发生.KRV并不感染胰岛β细胞,且只需短时间被呈递即可诱导糖尿病.如果一种病毒可在人类中诱发糖尿病,那么,我们认为,依靠相对短时间内监视个体的急性感染与胰岛自身抗体的最初表达可以发现这样的病毒,且此种具诱导作用的病毒应该普遍存在于体内.

第3阶段:活化的自身免疫

免疫细胞化学(ICA)试验检测一系列与多个已知自身抗原(除胰岛素外)反应的自身抗体,且其结果对于确定靶向分子十分重要.对ICA试验进行标准化及解释试验结果很困难,因为存在个体异质性,且试验需要利用冰冻的人类胰腺组织作为酶作用物.

胰岛自身抗体的表达是存在胰岛自身免疫反应的最佳标志.现已确认四种主要的胰岛自身抗原(即胰岛素、GAD65、IA-2和2nt8),且国际学术研讨会已证实检测这些自身抗体的试验的可靠性.ZnT8是最近被确认的自身抗原,它是胰岛特异性锌离子转运体,在将锌离子转运至胰岛素分泌颗粒的运输中发挥作用.有趣的是,ZnT8的一个导致单个氨基酸改变的普遍多态性是抗ZnT8自身抗体的主要目标.携带特定ZnT8变异的纯合子患者体内通常产生针对其本身基因组编码的变异体的自身抗体,这证明了此靶向作用本质为自身免疫反应.

预测1A型糖尿病的最简单方法是:四种“生化”自身抗体中有两种或两种以上的表达即预示个体有患糖尿病的风险.现在尚不知为何这样的组合性预测如此有效,但无效假设是这仅与统计学的概率有关.结合二项分布原理及Bayers原理,可以计算结合自身抗体检测的阳性率及阴性率的预测值.特别是通过计算可获得利用现有四个试验检测出一个或多个、两个或多个胰岛自身抗体的概率.若这些试验以第99百分位数值为界,约有4%的正常个体也可能出现一个或多个自身抗体阳性反应,然而只有0.06%的正常人出现两个及以上抗体阳性.若以第95位百分位数值为界,相应的假阳性率是1.4%.无论出自研究或临床目的,当试验的假阳性率达5%,联合多个试验将导致问题产生,可能造成1A型糖尿病低风险人群(例如临床诊断为2型糖尿病的患者)胰岛自身抗体的检测结果混乱.对于此类人群,以第95位百分位数值为界,可保持诊断的特异性(如1.4%的假阳性率),而不出现一个或多个自身抗体的表达.

“生物学”的胰岛自身抗体假阳性结果并不代表缺乏与自身抗原结合的自身抗体,亦不等于确定存在自身抗体的表达.可能存在真正的自身抗体表达,然而尚受它们识别的抗原表位、自身抗体的水平、缺乏多重自身抗体的表达等多个因素的影响,因此自身抗体表达并不一定意味着糖尿病患病风险增高.低亲和力胰岛素自身抗体可单独存在,而大多数具此类自身抗体的儿童并不会进展为糖尿病,即是很好的证明.最近,Hampe等报告,正常人具有个体基因型抗体,去除这种抗体后,正常血清对GAD65呈阳性反应.该实验系统复杂,且存在人单克隆抗GAD65自身抗体从微珠上被洗脱的可能.此新发现有待进一步研究的检测.

类似的,缺乏所有胰岛自身抗体的表达并不等同于不存在1A型糖尿病.在对儿童的糖尿病进程的随访过程中,常可观察到自身抗体表达的波动,可表现为一抗体水平降低而另一抗体水平升高.有一小部分自身抗体阳性的儿童在糖尿病发病前所有自身抗体表达均消失.如果患儿出现糖尿病表现但不表达四种标准生化自身抗体中的任意一个,按程序应考虑单基因突变糖尿病,因为糖尿病的罕见形式,如DIDMOAD/Wolfram综合征等,将对治疗的选择(如使用磺脲类药物)及疾病预后产生极大影响.据估计,缺乏胰岛自身抗体的糖尿病患儿中有10%属于单基因突变糖尿病.

胰岛素自身抗体非常独特,因为其滴度水平及阳性率与糖尿病发病时的年龄呈负相关关系.在引入胰岛素治疗数周内,几乎所有的个体均表达胰岛素抗体,现阶段尚无法区分此抗体与胰岛素自身抗体.胰岛素自身抗体通常(但并不一定)是患儿出生后体内第一个出现的抗体,随后依次出现的是GAD65,IA-2,ZnT8.总的来说,应该尽量避免使用标准化ELISA法测试这些抗体,然而,一种新型GAD检测方法运用抗GAD自身抗体取代标准ELISA法中的GAD自身抗原检测,这种方法在国际研讨会中获得好评.

临床上可能需要即时筛查测验以检测胰岛自身抗体,而且如果预防性治疗被引入临床实践,这种需要将变得迫切.现在大部分的检查论文范文主要是标本运输至实验室及相关文书工作的花费.如果可应用即时筛查测验,则可以在医生办公室内直接进行抗体检测,根据结果可建议进一步行确认实验,以及对表达一种及一种以上自身抗体的异常个体进行疾病分期.现在实验室最难掌握的检测技术是胰岛素自身抗体的测量,而多数检测GAD65、IA-2和ZnT8抗体的液态放射性分析技术在国际研讨会上已获得一致好评.

第4阶段:进行性代谢异常

可以通过多种途径来评价糖尿病患者的代谢异常进展状况.其中特异性最高的一种方法是经静脉的葡萄糖耐量试验.大部分病程在1年内的糖尿病患者接受葡萄糖注射后,产生1+3分钟胰岛素分泌,分泌量少于正常对照的第一位百分位数值.此法也是采用静脉注射途径的最不方便的方法之一.口服葡萄糖耐量试验亦能高效预测患者的病情恶化程度.在诸如DAISY的研究中,我们利用指尖采血法测量AIC水平.研究结果表明,绝大多数(但并非所有)糖尿病患儿的AIC水平于显性糖尿病发生前l~2年内在正常范围内逐渐升高.随着AIC水平渐升,则应采用口服葡萄糖耐量试验以明确糖尿病的诊断.

第5阶段:显性糖尿病

显性1A型糖尿病的进展通常十分迅速,或许这对于器官特异性自身免疫性疾病而言属于正常情况.在表达21羟化酶自身抗体的显性Addison氏病患者中,可以观察到类似的ACTH值急剧增加.可能大多数1A型糖尿病患者在患病数月甚至一年后才确诊为糖尿病,故他们的AIC水平升高,有些患者血糖水平甚至超过l,OOOmg/dl.在糖尿病发病时死亡的患儿,对他们进行评估的首位卫生工作者通常未能做出糖尿病的诊断,而延误治疗数天可能造成致命性的后果.在如DAISY之类的研究中,在预先确定有患糖尿病风险的儿童中,可以避免此类糖尿病以急性发病形式呈现.一旦糖尿病发生,之后对于疾病进程的随访应以C肽分泌能力的降低为首要监测指标.

第6阶段:胰岛素依赖阶段

关于长病程的1型糖尿病患者体内C肽和β细胞数量上的残存存在争议.例如,有证据表明一些儿童期起病的长病程糖尿病患者胰腺内尚残存一些表达胰岛素的细胞,同时亦存在β细胞凋亡.幸运的是,通过由Atkinson发起的nPOD项目,大部分从捐献遗体获得的胰腺可迅速被用于组织学分析,其优势之一是可获得整体形式的胰腺,故可对器官的多个部分进行分析.从1型糖尿病患者及非糖尿病患者捐献的遗体获得的胰腺均被进行分析,切片图片展示于网站上(www.jdrfnpod.org)以便国际性科研.研究者可用台式电脑观察这些切片,效果与通过显微镜观察一致.现已明确,部分儿童期起病的临床诊断为1型糖尿病的患者体内仍有大量的β细胞,这些患者胰岛内的任意地方都有β细胞,但可能这些患者并无1A型糖尿病,他们的疾病可能与发生在美国小部分人口中的、具酮症倾向的糖尿病有关.nPOD项目中大多数长病程的儿童期起病糖尿病患者胰腺的胰岛内无β细胞,大约10%的患者有少量具胰岛素分泌功能的胰岛组织含β细胞.这种小叶区尚存β细胞的异质性有可能解释此类患者的1A型糖尿病病程进展缓慢.这种情况使人联想到白癜风患者成片的皮肤中黑色素细胞的破坏(图5).

预防β细胞破坏的试验

虽然多种干预措施都未能成功地在诊断后预防l型糖尿病的进展或β细胞的破坏,我们正在进入一个有数种能够减轻β细胞破坏的免疫疗法时代,数个相关Ⅲ期临床试验正在进行或在计划中.然而,我们仍缺乏有关其长期疗效、安全性、发挥疗效途径等方面的关键信息,因此尚需进一步研究.从大体上可将这些免疫疗法分为两种,一种对机体整体发挥免疫抑制及免疫调节作用,另一种为抗原特异性的免疫疗法.以现有资料来看,免疫抑制/免疫调节试验有效的可能性更大,但其风险亦更高.在本文中,我将重点讨论四种疗法,它们均从一定程度上(因为缺乏“阳性”试验,而大规模的对照试验数目亦十分有限)被证明有效.

美国国立卫生研究所(NIH)糖尿病预防试验评估了对胞浆胰岛自身抗体阳性的1型糖尿病亲属从肠道外途径给予胰岛素及口服胰岛素(目的是诱导“口服耐受”)的方法.依照其胰岛素抗体表达情况、代谢异常情况及是否具有保护性HLA等位基因DQBl*0602,对研究对象进行分期.此外,对GAD65和ICA512自身抗体进行了测量,尽管未将此二者纳入预测患病风险的指标中.大规模的研究,如ENDIT预防性研究对烟碱进行研究,证明在相对大规模的情况下可对1型糖尿病进行预测,对患病的不同风险进行分级.总的来说,上述研究不能影响糖尿病病程的进展,但也有例外.在一个口服胰岛素试验中,一小群具有高水平胰岛素自身抗体的实验对象口服胰岛素后糖尿病进程显著减慢(图6).为此,NIH TrialNet小组正在进行相关研究,力图明确口服胰岛素治疗在表达多种胰岛自身抗体的胰岛自身抗体阳性的患者亲属及具胰岛素自身抗体者中是否能减缓糖尿病的进展.

在1型糖尿病发病时实验结果中的主要变量是残存C肽水平.GAD65是人类自身免疫的一个主要目标,因此GAD65是预测糖尿病进展的最优预测指标之一.一项小规模的随机对照实验结果表明,以明矾为免疫佐剂的GAD65可延迟C肽水平的降低,但尚不能改善患者AIC水平或减少胰岛素需求量.关于明确GAD65疫苗作用的相关验证性试验正在进行中,其中包括一项新近启动的TrialNet研究.

在两个单独利用两种不同的抗CD3抗体的实验中,C肽分泌能力丧失均得以明显延迟.实验对抗CD3抗体进行了改进,以减少细胞因子释放、限制急性毒性作用.C肽分泌能力丧失被延缓至6—l2个月后,之后C肽水平继续降低(尽管已被延缓),与对照组相似.胰岛素利用率降低与C肽降低减少相关.有证据表明,除了引起急性及一过性T细胞耗竭,上述疗法还能诱导调节性T细胞特别是CD8调节性T细胞生成.Ⅲ期实验需要进行更长时间的随访及对更多的个体进行评估,以判断此疗法的有效性及潜在毒性.

一项近期的TrialNet研究指出,单独应用抗B细胞抗体一抗CD20,能显著延缓C肽丧失,改善AIC水平,减少胰岛素需求量.数月到一年内,抗CD20减少循环中的B淋巴细胞,但并不以浆细胞为目标.许多抗体水平在此疗法中无变化,而特定的自身抗体被明显抑制.抗CD20抗体曾被用于B细胞淋巴瘤的治疗,且对于多发性硬化及风湿性关节炎均有效.故较抗CD3抗体,抗CD20抗体的应用有更多的相关经验.尽管如此,必须进行进一步试验以评价将其作为一种药物单独用于治疗糖尿病患者及新发糖尿病患者的有效性和安全性.更新的抗CD20抗体及一系列治疗性靶向B细胞正在研制中.从动物实验中已经获得证据,表明调节性B细胞被诱导生成,且B细胞可能对于胰岛自身抗体的表达有重要作用.

到目前为止,上述疗法均无法取得长期、彻底阻止糖尿病进展的效果.引人注目的是,尽管糖尿病进展为十分缓慢的破坏性进程,1A型糖尿病的自身免疫反应对于免疫治疗疗效反应极弱.这可能是因为上述疗法并未消除潜在的驱动p细胞破坏的T细胞相关记忆.或许,多途径疗法或联合治疗能够达到长期缓解疾病的目的.而长期、持续性免疫抑制疗法必然不是治疗l型糖尿病的选择.

大约每300个随机选择的遗体捐献者中就有1人表达多种胰岛自身抗体,因此可能约有一百万美国人正处在l型糖尿病的发展过程中.随着免疫调节/免疫抑制疗法的改进,或抗原特异性治疗的发展,我们相信慢性活动性胰岛炎可能会像慢性活动性肝炎一样成为可治疗的病变.

(谭婷婷 编译 周智广 审校中南大学湘雅二医院内分泌科/中南大学糖尿病中心)

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胰岛素引用文献:

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