有关水稻抗病基因Lrr19类似物序列毕业论文写作资料-论文写作网

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基因序列论文范文

摘要根据GeneBank数据库中已知水稻抗病基因Lrr19类似物序列,设计引物,比较普通野生稻、粳稻和籼稻的基因序列,初步分析了3种水稻Lrr19类似物的序列差异,与小麦抗病基因Lrr19编码序列的同源性.结果发现在水稻不同品系间发生部分位点碱基的变化,相似性为97%～98%；水稻中该类似物编码的蛋白质与小麦的LRR19有较高的同源性（54%～55%）,籼稻、粳稻和普通野生稻编码蛋白都在相同的位置存在NB-ARC和LRR结构域,并且与小麦LRR19蛋白相似.推测水稻Lrr19基因类似物是抗性相关基因,并且在水稻不同品种间序列差异不大,相对较为保守.

关键词水稻；抗病基因；Lrr19；类似物

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0013-03

Study on Sequence Analysis of Lrr19 Resistance Gene Analog in Rice

LIAO Cheng-hong 1 LI Shuai 1 JIN Jia-lu 2

（1 College of Agriculture,Hainan University,Haikou Hainan 570228； 2 Hebi College of Vocation and Technology）

Abstract The primers were designed based on Lrr19,a known resistance gene analog of rice in GeneBank and used to amplify the sequence in commom wild rice,japonica and indica rice. After sequencing,the sequences of 3 kinds of rices were analyzed preliminary and compared with the homology of Lrr19 resistance gene coding sequence in triticum aestivum. The results showed that there were some different sites among wild rice and cultivated rice,the nucleotide similarity were 97%~98%. The comparability of the amino acid sequences of rice and triticum aestivum were between 54% and 55% respectively. NB-ARC and LRR domains were predicted in the same position of japonica,indica rice and commom wild rice,which was similar with LRR19 protain in triticum aestivum. It was inferred that Lrr19 was related to resistance,had a little difference among sequences in different rice varieties and was important for its conservation.

Key words rice；resistance gene；Lrr19；analog

自1992年第1个植物抗病基因Hm1被克隆[1]以来,人们不断发现已克隆的抗病基因存在一些相似的结构域,如NBS、LRR、TIR、STK、LZ、CC等[2-5].1996年Kanazin和Yu开展了使用这些结构域设计简并引物从基因组DNA中进行扩增的研究[6-7].由于扩增的产物与抗病基因有较高的同源性,一些研究者将其分别称为抗性基因同源类似物Resistance gene analog（RGA）[6].

亮氨酸富集重复序列（LRR）是长度在24个氨基酸之内的多重重复,它含有多个亮氨酸或其他亲水残基,也含有有分配规律的脯氨酸和天冬氨酸.LRR存在于许多功能不同的蛋白质中,它与蛋白质之间的相互作用及信号转导有着非常密切的关系.人们还发现在抗病基因RPS2、RPM1和N的LRR结构域中单个氨基酸的变化可导致抗病反应的消失和减弱[7],而且如果单独在水稻中表达Xa21蛋白的LRR,也可表现出对水稻白叶枯病菌的部分抗性[8].这些研究表明LRR结构中微小的修饰就容易破坏LRR的功能,表明LRR在植物抗病过程中具有重要作用[9].Lrr19是一个小麦抗论文范文病相关基因,其编码蛋白的分子功能是与ATP非共价键结合并选择性相互作用,是一种普遍的重要的辅酶和酶调节因子[10],其功能与蛋白激酶有关[11].2003年,Kikuchi等从粳稻品种日本晴中克隆出小麦抗病基因Lrr19的类似物[12].目前,对水稻抗病基因类似物Lrr19结构和功能的研究鲜见报道.

通过比较普通野生稻（Oryzarufipogon Griff.）、粳稻（Japo-nica）和籼稻（Indica）3种水稻的Lrr19基因序列,初步分析这3种水稻品系在分化上的关系.同时将这3个品种的水稻Lrr19类似物分别与已发表的小麦抗病基因Lrr19编码序列进行同源性分析,预测其蛋白结构域,推测其分子功能,为进一步研究该基因在水稻中的功能及抗病机制提供支持.

1. 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为普通野生稻、籼稻（9311、广陆矮4号和桔农占）和粳稻（日本晴）嫩叶,采集于海南省农业科学院粮食作物研究所和海南大学农学院.试验试剂：2%CTAB（十六烷基三论文范文溴化铵）、1×TE、6×Loading buffer、氯仿∶异戊醇（24∶1）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、核酸染料（goldviewTM）、Marker、50×TAE、1×TAE.

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取.采用CTAB法提取水稻基因组DNA.用紫外分光光度法对提取的基因组DNA定量,检测其浓度和纯度,稀释成工作液放置4 ℃备用.

1.2.2 引物设计和PCR扩增.根据GenBank数据库中水稻Lrr19类似物基因的编码区核苷酸序列设计引物,该基因仅有1个外显子,但长度约3 kb,因此共用3对引物以达到扩增和测序的目的.

PCR扩增体系为25 μL,含DNA模板（50 ng）1μL,10×Buffer 2.5 μL（Mg2+ 1.5 mmoL/L）、dNTP 1 μL、正反向引物各0.5 μL（10 mmoL/L）、Taq论文范文酶1U.反应程序为：预变性95 ℃,5 min,3步循环94 ℃ 30 s,55~62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环后,于72 ℃延伸10 min.反应终止后将其放置在4 ℃保存.

PCR产物采用2%琼脂糖电泳检测割胶,经胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收后,送至上海生工生物工程有限公司进行测序.为了保证序列的准确性,每个样品正反双向测序.

1.2.3 序列分析.将所测DNA序列用DNASTAR软件包进行编辑,并以GenBank上已发表的小麦Lrr19序列（AF325196）为参考序列,人工正反链核对.用ClustalX1.81对序列进行比对,利用Mega4.0软件对碱基组成分析,采用Kimura2 para-meter（K2P）模型构建NJ树；利用NCBI网站的Conserved domains功能模块进行结构域分析.

2. 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

PCR扩增结果见图1.

2.2 核苷酸序列分析

利用特异性引物,将水稻抗性基因Lrr19类似物的编码区扩增序列进行对比,结果发现普通野生稻、籼稻和粳稻之间序列存在一定的核苷酸差异（图2）,主要差异发生在普通野生稻和籼稻的9311、桔农占中.核苷酸的相似性为97%～98%.

2.3 构建系统进化发育树

根据GeneBank数据库中小麦Lrr19（AF325196）序列和测序获得的核苷酸序列,利用Mega4.0软件构建系统发育树（图3）.从图3可以看出,小麦Lrr19作为外群位于发育树外层,普通野生稻作为粳稻和籼稻的共同祖先,位于籼稻和粳稻的外层.9311与桔农占同为籼稻,聚在一类,但籼稻广陆矮4号和粳稻日本晴同在一起.这可能是由于人工栽培过程中,该基因在9311和桔农占中发生更多碱基位点的变化.

2.4 氨基酸序列分析

普通野生稻和栽培稻的Lrr19类似物分别与小麦Lrr19进行氨基酸序列比对,结果发现水稻中该基因与小麦Lrr19的同源性为54%,具有较高的同源性.氨基酸统计结果显示亮氨酸含量非常较高,所占比例为14%左右,因此推测水稻种存在LRR结构域（图4）.利用NCBI网站的Conserveddo-mains功能模块进行结构域预测,结果显示籼稻、粳稻和普通野生稻编码蛋白都在相同的位置存在NB-ARC和LRR结构域,并且与小麦LRR19蛋白相似,因此可以认为水稻的LRR19RGA具有和小麦LRR19一样的与ATP结合并相互作用的分子功能.

3. 结论与讨论

研究结果表明,在对普通野生稻、籼稻和粳稻的的序列分析中,发现三者间核苷酸差异主要存在于普通野生稻中,这与水稻的起源进化是一致的.通过氨基酸同源性比较分析,三者与小麦LRR19氨基酸序列的同源性较高,水稻中该基因中存在核苷酸结合位点（NBS）和亮氨酸富集重复序列（LRR）,说明水稻Lrr19基因类似物与小麦Lrr19具有相同抗病基因的保守结构域,籼稻、粳稻和普通野生稻编码蛋白都在相同的位置存在NB-ARC和LRR结构域,并且与小麦LRR19蛋白相似,推测水稻Lrr19基因类似物也具有与ATP结合并相互作用的分子功能,是一种抗性基因[13-14],在不同水稻品种间具有一定的保守性.目前对于Lrr19的研究仅限于小麦论文范文病抗性相关的功能,但对该基因在水稻中的抗病机制还有待深入.

目前在水稻[15]、大豆[16]、小麦[17]、甘薯[18]等传统作物中已获得了许多抗病基因同源序列RGA,显示了广泛的应用前景.现在将cDNA克隆、转基因技术等结合起来,在植物抗病基因研究方面有了更多的发现,将为进一步研究植物抗病基因提供可能.

近年来通过植物对外界病原体的抗病遗传分析研究表明,植物对特定病原体的抗性是由单个基因（R）控制的[13].研究并克隆植物抗病基因（R）成为植物抗病研究的一个热点.随着R基因克隆数目的逐渐增加,比较其序列的相似性发现这些R基因存在共同的特征,即其氨基酸序列具有保守区,如LRR、NBS[14]等.其中NBS-LRR类R基因克隆得最多,尽管这些基因DNA序列各不相同,但编码的蛋白质氨基酸序列局部区域如NBS区域是非常保守的.因此,通过分析抗病基因类似物的序列结构,进一步预测其可能的生物学功能,成为了解各种植物抗病基因类似物的有效途径.

4. 参考文献

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