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李思银 杨玉艾 毕保良 杨亮宇*
（云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201）
摘 要 采用外周血液淋巴细胞培养法制备大额牛与云南黄牛杂交公牛的染色体标本,对大额牛与云南黄牛杂交公牛的染色体核型和G-带带型进行研究.结果表明,大额牛与云南黄牛杂交公牛染色体数目2n等于59,其中2×28+1条常染色体中,t即2+28染色体为近中着丝粒染色体,其余2×27+1+1条均为端着丝粒染色体；1对性染色体中,X为近中着丝粒染色体,Y为一条小的端着丝粒染色体.大额牛与云南黄牛杂交公牛染色体数目2n等于59,核型为：59,-2,-28,+t（2∶28）,XY.
关键词 大额牛；云南黄牛；杂交公牛；染色体；核型；G-带
中图分类号 S823.8；S813 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）23-0329-02
Ananlysis on Karyotype and G-banding of Chromosomes in Male Hybrid of B. Frontalis×Yunnan Bos Taurus
LI Si-yin YANG Yu-ai BI Bao-liang YANG Liang-yu *
（College of Animal Science and Technology,Yunnan Agriculture University,Kunming Yunnan 650201）
Abstract The chromosome samples and G-banding samples were made by peripheral blood lymphocyte culture to analyze the karyotype and G-banding pattern of the chromosomes in male hybrid of B. Frontalis×Yunnan Bos Taurus. Results showed that the number of the chromosomes in the male hybrid of B. Frontalis×Yunnan Bos Taurus was 59. There were 2×28+1 autosomes and 1 pair of sex-chromosome. Among 2×28+1 autosomes,t（2+28）was submetacentric chromosome,the others 2×27+1+1 autosomes were telocentric chromosomes.X chromosome was submetacentric chromosome,Y chromosome was a 论文范文all telocentric chromosomes. The number of the chromosomes in the male hybrid of B. Frontalis×Yunnan Bos Taurus was 59,and the karyotype was 59,-2,-28,+t（2∶28）,XY.
Key words B. Frontalis；Yunnan Bos Taurus；male Hybrid；chromosome；karyotype；G-banding
大额牛（Gayal,Bos frontalis）仅分布于云南西部高黎贡山的独龙江和怒江流域,以及印度、孟加拉和缅甸,是一种为数很少的半野生半家养的珍贵畜类[1-2].研究表明,大额牛不仅生存能力强,适应性广,繁殖能力强,而且具有典型的肉用牛体型和较好的产肉性能（生长速度快,肌纤维细、嫩度好）[3],具有极高的学术研究价值和开发利用价值.但受社会经济、自然气候条件等因素的制约,目前大额牛数量很少,濒于灭绝,而且关于大额牛的科学研究尚较少[4-7].
大额牛与黄牛杂交形成的云南大额牛母牛可以自行繁殖,但公牛是否可育目前尚无明确定论,这是解决种间杂交不育的珍贵材料.临床上染色体检查的目的就是为了发现染色体异常和诊断由染色体异常引起的疾病.因此,本研究拟通过大额牛及大额牛与普通黄牛杂交公牛的染色体核型检测,初步分析大额牛与云南黄牛杂交公牛是否可育,进而探讨其可能的机制,为进一步说明云南大额牛可能形成的路径,以及确定大额牛的分类地位、杂交利用、杂交改良提供依据.
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1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试动物为来自云南农业大学后山实习牛场的成年大额牛公牛和大额牛与云南黄牛的杂交公牛,编号分别为F01、DB007.供试牛血液样品：在动物清醒状态下,尾静脉采血,肝素管抗凝.
1.2 试验方法
1.2.1 培养基制备.培养基按无菌要求制备,RPMI Medium-1640 1 000 mL加NaHCO3 2 g,然后按RPMI Medium-1640培养液80%、犊牛血清20%、双抗（链霉素、庆大霉素）各100 IU/mL、Sigma公司产PHA 30～60 μg/mL、用5% NaHCO3调节pH值至约7.2.除菌膜过滤后装瓶加塞,置于冰箱冷冻保存备用.
1.2.2 培养条件.按外周血淋巴细胞制备染色体的方法[8]进行适当修改制备染色体标本,即每个培养瓶加培养基5 mL,加血0.3～0.5 mL,置于（37.0±0.5）℃连续培养72 h.
1.2.3 收集细胞及制片.于结束培养前4 h加入质量分数0.001%的秋水仙素2滴（秋水仙素最终浓度为0.4～0.8 μg/mL）,摇匀后继续培养,按预定时间培养完成后取出,放入离心管内,以1 500～2 000 r/min,离心5 min,弃上清液.沉淀物中加入0.075 moL/L KCl低渗液5 mL,吹打均匀后放入37 ℃恒温箱中静置15 min.低渗完毕后,在每瓶中加入甲醇∶冰乙酸为3∶1的新鲜固定液1 mL,预固定5 min,然后离心5 min,弃去上清液后加入固定液5 mL吹打均匀,固定15 min,离心5 min,弃去上清液,如此反复2～3次.最后加入固定液0.5～1.0 mL,打匀制成细胞悬浮液.滴片,干燥.
1.2.4 染色体G-带标本的制备.将常规方法制得的玻片（未染色）置于烤箱30 ℃老化48 h,断电自然冷却备用.取0.25%胰蛋白酶原液200 μL加入pH值为6.8的PBS液20 mL中,配成胰蛋白酶溶液.将玻片浸入其中,处理2～3 min,取出后用pH值为6.8的PBS液漂洗,用Giemsa染液（Giemsa原液∶pH值为6.8的PBS为1∶9,v/v）染色10 min.自来水冲洗,自然晾干,镜检.
2. 结果与分析
2.1 染色体数目统计
挑选50个形态清晰、分散良好、收缩适中的染色体中期分裂相,进行显微拍照,并统计染色体数目.结果显示,F01的染色体数目2n等于58的细胞有48个,占96%,确定其染色体数为2n等于58,其中28对为常染色体,1对为性染色体（图1）.DB007的染色体数目2n等于59的细胞有47个,占94%,确定其染色体数为2n等于59,其中57条为常染色体,1对为性染色体（图2）.
2.2 染色体核型分析
染色体形态、G-带分析结果表明：①大额牛公牛F01染色体2n等于58,其中28对常染色体中1号为近中着丝粒染色体,其余27对均为端着丝粒染色体；性染色体中X染色体为近中着丝粒染色体,Y染色体为一条小的端着丝粒染色体（图3）,此结果与曾养志等[9]报道的Y染色体为一条最小的近中着丝粒染色体存在差异.对比大额牛与普通黄牛的染色体核型发现,大额牛的1号染色体同源于黄牛的2号和28号染色体,大额牛与云南普通黄牛染色体对应关系见表1.②大额牛与云南黄牛的杂交公牛DB007的核型为：59,-2,-28,+t（2∶28）,XY（图4）.其中2×28+1条常染色体中,t即2+28染色体为近中着丝粒染色体,其余2×27+1+1条均为端着丝粒染色体；性染色体中,X为近中着丝粒染色体,Y为一条小的端着丝粒染色体.通过对比分析大额牛、云南普通黄牛及大额牛与云南黄牛杂交公牛的染色体核型,发现杂交公牛DB007的染色体1/2来自父本大额牛,1/2来自母本黄牛.在DB007的2×28+1条常染色体中,1号染色体一条来自黄牛的1号,1条来自大额牛的2号；29号染色体1条来自黄牛29号,1条来自大额牛28号；3~27号染色体均为黄牛、大额牛一一对应；2号和28号均来自黄牛,t即2+28染色体可能为大额牛的1号染色体（1 q +1 p）；性染色体X来自母本黄牛,Y来自父本大额牛.染色体间的对应关系如表1所示.③F01与DB007的Y染色体均为一条小的端着丝粒染色体,此结果虽与曾养志等[9]报道的Y染色体为一条最小的近中着丝粒染色体存在差异,但并不矛盾.
3. 结论与讨论
试验结果表明,大额牛和大额牛与云南黄牛的杂交公牛存在一定比例体细胞染色体2n≠58和2n≠59的情况,这可能是由于体细胞染色体数目变异和结构变异,或是试验过程中低渗过度、吹打过猛使中期染色体消失[10],或是在计数时将某些不是染色体的物质错当染色体纳入计数所致.
该试验在对样本进行G-带分析时发现,牛G-带带纹的显现与胰蛋白酶的处理时间有关.胰蛋白酶处理时间过长,染色体膨胀、变形、变淡,观察不到清楚的带纹；胰酶时间处理过短,仍不能显示清楚的带纹.染色体空白片的老化时间和合适的胰酶处理时间是获得良好带型的关键.同时,染色体的浓度和染色时间的长短也会对带纹的清晰度产生影响.试验结果初步表明：大额牛与云南黄牛杂交公牛DB007的染色体2n等于59,染色体数目为奇数,因此可能会造成雄性生殖细胞的RNA翻译紊乱,使某些正常表达的基因不能完全表达,或使某些该抑制的基因不能充分抑制,虽然个体有存活的可能,但会对其生育能力造成一定的影响（同源染色体配对紊乱）,因此可初步认为大额牛和普通黄牛杂交后的公牛缺乏生育能力,但由于样本只有1个,此结果是否能代表大额牛与云南黄牛杂交公牛的染色体分析结果,还有待进一步证实,而且大额牛与普通黄牛杂交后代的育性还有待于从精子质量等方面作进一步的研究.
4. 参考文献
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总结：本文关于染色体黄牛论文范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考。
鹿晗怒斥跟车黄牛引用文献:
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[2] 黄牛毕业论文格式模板范文 黄牛论文如何写2000字
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