简介:关于对写作质粒菌株论文范文与课题研究的大学硕士、相关本科毕业论文质粒菌株论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料下载有帮助。
关键词 仔猪大肠杆菌；菌毛基因；多重PCR；质粒指纹图谱；广西壮族自治区
中图分类号 S858.285.1+2；Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2010）07-0349-03
Detection of Fimbrial Gene of Pathogenic Escherichia coli from Piglets in Guangxi Region by Multiplex PCR Assay and Its Pla论文范文id Profile Analysis
XIE Yong-ping PENG Hao CHEN Ze-xiang YANG Wei
（Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning Guangxi 530001）
Abstract The fimbrial gene of fifty-six strains of pathogenic Escherichia coli from piglets in Guangxi were detected by multiplex PCR and analysised by pla论文范文id profile.The results showed that the multiplex PCR assay could be used to detect the wild type E.coli strains and also had been proved to be the useful method for rapid diagnosis and epidemiological investigation of piglets diarrhoea caused by E.coli.Pla论文范文id were discovered in all E.coli strains and the isolates from different sources had distinct pla论文范文id patterns,while those from same sources held same pla论文范文ids.All strains contained a pla论文范文id with the same size,which indicated that the pathogenic E.coli caused piglets diarrhoea in Guangxi had one common pla论文范文id. The results of analysis suggested that Pla论文范文id DNA Finger Printing method is useful to subtype the Escherichia coli.
Key words piglets；Escherichia coli；fimbrial gene；multiplex PCR；pla论文范文id profile analysis；Guangxi zhuang Aotonomous Region
致病性大肠杆菌所致的腹泻是仔猪腹泻最主要的原因,各地普遍存在[1].随着养猪向规模化发展,仔猪黄、白痢在我国及世界各地均有发生,目前仍是我国养猪业健康发展的严重制约因素[2].黄、白痢的大肠杆菌的致病性与菌株的粘附性菌毛、肠毒素、R 质粒等有关[3].致病性大肠杆菌常具有K88、K99、987P等粘附性菌毛中的一种或几种[3].粘附性菌毛的检测对致病性大肠杆菌的诊断具有重要意义.
而肠毒素及R质粒的基因主要由大肠杆菌的质粒所编码[4],笔者在对广西地区规模化猪场56株大肠杆菌分离株进行培养及生化鉴定的基础上,并对所有分离株的菌毛基因进行多重PCR检测及质粒指纹图谱分析,为研究仔猪致病性大肠杆菌腹泻病的快速诊断和分子流行病学调查奠定了基础.
1. 材料与方法
1.1 供试菌株
56株大肠杆菌来源于广西壮族自治区不同规模化猪场临诊发生典型仔猪黄、白痢猪只的肛拭粪样或死亡猪只心血和肝中分离,在普通肉汤中呈均匀混浊,液面有菌膜,管底有白色沉淀,振荡呈云雾状散开；普通琼脂平板上生长呈灰白色、半透明,表面隆起,光滑湿润,边缘整齐的圆形菌落,直径1～3 mm；麦康凯上生长呈粉红色菌落；伊红美兰上生长菌落呈紫黑色带金属光泽；能使三糖铁斜面变黄,底柱产气,但不产H2S；均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等多种糖类,产酸产气,能运动,不分解尿素,M.R试验阳性,V.P试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性.这些特性与大肠杆菌相符,可初步鉴定这56株为大肠杆菌株,并经小白鼠致病性检测、生化反应鉴定为致病性大肠杆菌.营养琼脂斜面保存于广西兽医论文范文细菌论文范文.猪场分别是：RS （融水）6、RS8、RS10、RS11、RS13、RS14、RS16号,ZY（资源）2、ZY3、ZY4、ZY9、ZY10,GY（灌阳）1、GY3、GY5、GY9,YS（阳朔）3、YS8,LP（荔浦）2、LP4、LP6、LP8,LX（柳鑫）1、LX2、LX4、LX4-1、LX4-2、LX4-3、LX4-4、LX4-5,WX（武宣）11、WX12,NN（南宁）1、NN2、NN3、NN4、NN5、NN6,PL（平乐）6、PL 7,FC（防城）2、FC7、FC8、FC11,QZ（钦州）1、QZ2、QZ3、QZ4、QZ5、QZ6、QZ7、QZ8、QZ9、QZ10、QZ11、QZ12（猪场地区相同、编号不同表示来自于同一地区不同猪场）.
1.2 供试培养基及药品试剂
麦康凯、营养肉汤干粉培养基和肠道菌科细菌微量生化鉴定管购自杭州天和生化仪器公司.λDNA/Hind III、PCR Taqmix、DNA MarkerⅡ购自自广州东盛生物科技有限公司,溶菌酶、细菌基因组DNA提取试剂盒与质粒小提中量试剂盒均购自天根生物公司.
1.3 多重PCR检测
1.3.1 引物合成.K88、K99、987P引物参照华荣虹等[4]方法.K88上游引物5′-AATGG论文范文CG GTCGATATCG-3′,下游引物5′-TACTGGCGTAGCAAATGC-3′,预计扩增片段长度为210 bp左右；K99上游引物5′-TAT TATC论文范文AGGTGGTATGG-3′,下游引物5′-GGTATCC论文范文TAGCAGCAGTA论文范文TC-3′,预计扩增片段长度为314 bp左右；987P上游引物 5′-CTGCCAGTC TATGCCAAGTG-3′,下游引物5′-ACGGTGTACCTGCTGAA CGAATA G-3′,预计扩增片段长度为519 bp左右.各引物均由大连宝生物公司合成.
1.3.2 细菌DNA的提取.参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行.
1.3.3 PCR扩增.以所提取各细菌DNA 1μL为模板进行PCR.PCR循环条件为：95 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性40 s、50 ℃复性40 s、72 ℃延伸1 min进行,35个循环,72 ℃延伸10 min.反应结束后取20 μL产物用于1%琼脂糖凝胶电泳分析.
1.4 质粒DNA的提取
参照质粒小提中量试剂盒提取说明书进行.
1.4.1 琼脂糖凝胶电泳.采用水平式琼脂糖凝胶板电泳,凝胶浓度为0.7%,电泳缓冲液为TBE,电压90V.于含0.5 g/100mL溴化乙锭溶液中染15～20 min,用凝胶成像分析系统观察.
1.4.2 质粒片段大小的估算.质粒DNA 及酶切片段大小估计按Hanse等[5]的方法进行.以标准λDNA 的Hind III酶切片段（其分子分别含有23 100、9 400、6 600、4 400、2 300、2 000 bp）的电泳结果为标准系统,以相对迁移率为自变量,碱基数的对数为因变量,建立回归方程,换算出质粒及酶切片段的碱基数.每次电泳均设有标准λDNA的Hind III酶切系统作标准.
2. 结果与分析
2.1 多重PCR
以各株致病性大肠杆菌DNA为模板,优化PCR条件,成功扩增出与预期结果相符的相应特异性片段,试验结果见图1.用常规分离培养方法,分离得到56株猪源大肠杆菌,以多重PCR方法进行基因分型,检测结果为K88有49株,K99有6株,K88+987P有1株.
2.2 56株大肠杆菌的质粒特征指纹图谱
整理56株大肠杆菌质粒DNA电泳结果,得到17种质粒图谱谱型（表1）.从表1可以看出,只有1条质粒带的有6株,有2条质粒带的有12株,有3质粒带的有25株,有4条质粒带的有7株,具有5条或6条质粒带的各3株,以有3条质粒带的菌株为优势菌株.各株大肠杆菌均有1条大约23 100 bp的质粒带,来自相同地区猪场的菌株大多具有更多相同大小的质粒条带,提示各地区流行菌株所含质粒可能具有一定的同源性,具有相近的亲缘关系.
宝赛质粒菌株保藏中心:白色金针菇406菌株的选育
3. 结论与讨论
猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种仔猪肠道传染病.大肠杆菌致病与其具有粘附性菌毛和产肠毒素密切相关.猪源肠毒素性大肠杆菌常具有K88、K99、987P粘附性菌毛中的1种或几种.常规检测大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜观察,D-甘露糖抵抗血凝试验,细胞粘附试验和免疫血清学技术.这些方法操作繁琐,特异性不高,大部分还不能对菌毛进行分型检测.对病原菌的分子生物学检测包括多种方法,如PCR 技术、基因芯片技术、噬菌体分型技术、脉冲场凝胶电泳分析技术等[6].华荣虹[4]以粘附性菌毛结构基因的保守区段为模板,建立了1个多重PCR反应体系,对各种菌毛阳性标准菌株及其不同组合和菌毛阴性对照菌株的扩增结果表明此体系特异性好.本试验通过56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测,进一步证实了多重PCR的方法在对各类大肠杆菌野生菌株的检测也是可行的,该方法可用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查.
运用多重PCR检测发现流行于广西自治区规模化猪场的致病性大肠杆菌所具有的粘附性菌毛通常以K88为主,此次所调查的56株致病性大肠杆菌中K88菌毛49株,K99菌毛6株,K88+987P菌毛1株.这与许建民等[7]是猪源ETEC的一种主要粘附素的相关报道一致.在特定环境及宿主条件下,致病性大肠杆菌菌株在小肠上皮的粘附程度是导致胃肠功能紊乱的主要原因,检测粘附性菌毛对大肠杆菌性腹泻的诊断十分重要,因此利用多重PCR等方法建立快速检测粘附性菌毛基因无疑有着重要的意义.
流行病学调查在细菌性传染病的研究中占有重要位置.对于病原菌的追踪、分型,人们根据其生物学特征已经建立了许多表型分型方法,如生化指纹分型、噬菌体敏感性分型、抗生素敏感性分型、菌毛分型、外膜蛋白图谱分型、血清学分型等.这些分型方法依赖于细菌的表型,其稳定性差,且敏感度低,有些必要的试剂也不易得到.为了克服这些不足,有必要将分子生物学技术用于流行病学调查.据报道,质粒指纹图谱分析用于暴发流行菌株的鉴定,特异性与噬菌体分型相当,远优于血清学、生化指纹分型、药敏试验等[8-9].朱向玲等[10]了解大肠杆菌分离菌株的分子特征,建立了随机扩增多态性和质粒指纹图谱种分型方法,对从粪便和动物组织分离的大肠杆菌进行了分型研究,结合主要毒力基因的检测和药敏试验,以进一步验证分离菌株之间的亲缘关比较随机扩增多态性和质粒指纹图谱种分型方法发现它们虽具有相似的结果,但质粒图谱法分析更能反映出菌株之间的亲缘关系.
本试验中分离菌株的质粒获得率为100%,说明大肠埃希氏菌适合用质粒指纹图谱法进行分析.对56株致病性大肠埃希氏菌进行质粒分型,共分为17种质粒谱型.同一来源的菌株大多具有类似的质粒谱型,同一地区暴发流行的菌株含有相似的流行质粒.因此,可以推测细菌的暴发流行可能是某些流行质粒的流行.可以根据不同起暴发流行菌株是否含有相同的流行质粒来判断这些菌株之间的相关性.本试验分离到的56株致病性大肠杆菌的质粒指纹图谱显示来自相同地区猪场的菌株大多具有更多相同大小的质粒条带.这与赵宗胜等[11]认为一般在同一地区流行的大肠杆菌病均以少数几个流行质粒为主的结论相一致.此次调查所有菌株都含有1 条大小约为23 100 bp的质粒带,这提示广西地区近年来流行致病性大肠杆菌优势菌株可能具有高度同源性.从图谱谱型上还可发现流行菌株间,即使是来源于同一地区的菌株其质粒图谱也不完全相同,存在一定的差异.这种差异可能是传染病暴发流行时细菌在广泛传播过程中发生了分子生物学的演化所致[12].
4. 参考文献
[1] 严惠群,金忠明,严甦,等.仔猪腹泻病因与防制对策[J].中国畜牧兽医,2008,35（6）：81-83.
[2] 王红宁,刘世贵,刘书亮,等.规模化猪场仔猪黄、白痢的防治研究[J].中国预防兽医学报,1999,21（4）：264-267.
[3] 程伯鲲.致泻性大肠埃希氏菌的毒力因子[J].中国人畜共患病学报,1998,14（5）：59-64.
[4] 华荣虹,张书霞,何孔旺.猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医学报,2006,26（2）：162-164.
[5] HANSE J B,OLSEN R H.Isolation of large bacterial pla论文范文ids and characterization of the P2 incompatibility group pla论文范文ids PM G1 and PM G5[J].J Bacteriol,1973（135）：227-230.
[6] KIM J S,LEE G G,PARK J S,et al.A novel multiplex PCR assay for rapid and simultaneous detection of five pathogenic bacteria：Escherichia coli O157∶H7,Salmonella,Staphylococcus aureus,Listeria monocytog-enes,and Viberio parahaemolyticus[J].J Food Prot,2007,70（7）：1656-1662.
[7] 许建民,赵德明.仔猪肠毒素性大肠杆菌病的防治[J].中国兽医杂志,2005,41（2）：48-49.
[8] 汪文正,韩文瑜,王世若.质粒指纹图谱法对猪大肠杆菌病的分子流行病学研究.[J]中国兽医科技,1998,28（2）：21-23.
[9] 汪文正,韩文瑜,王世若.猪致病性大肠杆菌的质粒指纹图谱分析[J].中国兽医学报,1998,18（5）：475-478.
[10] 朱向玲,严亚贤,陆承平,等.运用随机扩增多态性和质粒指纹图谱法进行大肠杆菌O157的分子多态性分析[J].上海交通大学学报：农业科学版,2008,26（4）：259-263.
[11] 赵宗胜,储岳峰,王晓兰,等.应用质粒图谱分析大肠埃希氏菌毒力差异的研究[J].中国兽医科技,2001,31（4）：9-11.
[12] 盘宝进,谢永平,杨威,等.用质粒DNA指纹图谱法分析猪水肿病大肠杆菌的流行病学特征[J].中国畜牧兽医,2006,33（10）：6-8.
总结：此文是一篇质粒菌株论文范文,为你的毕业论文写作提供有价值的参考。
宝赛质粒菌株保藏中心引用文献:
[1] 超市配送中心方向论文选题 超市配送中心论文题目如何取
[2] 比较好写的加工中心高级技师论文题目 加工中心高级技师论文题目哪个好
[3] 加工中心技师论文选题推荐 加工中心技师论文题目怎么定
