《枇杷果实中NAD MDH基因克隆与植物表达载体构建》
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摘 要：为探索枇杷果实中苹果酸的积累与降解机制,从枇杷果实转录组中得到NADMDH的开放阅读框的基因序列.以枇杷高酸品种解放钟和低酸品种白梨为材料,提取果实中总RNA,运用RTPCR技术克隆出枇杷果实中苹果酸合成酶基因NADMDH,并进行荧光定量PCR分析.结果表明：枇杷果实中苹果酸合成酶基因NADMDH的开放阅读框（ORF）为996 bp,共编码了332个氨基酸.经荧光定量PCR分析,解放钟和白梨在花期后95 d时NADMDH基因表达量最高;花后80～105 d,NADMDH基因在高酸与低酸品种间存在显著差异.采用无缝克隆技术成功构建了植物表达载体EjNADMDHPBI121,并导入根瘤农杆菌EHA105中得到植物转化工程菌,为后期利用转基因技术改良枇杷果实品质及遗传改良打下基础.
关键词：枇杷;NADMDH基因;基因克隆;表達分析;载体构建
中图分类号：S667.3文献标志码：A文章编号：0253-2301（2020）04-0001-08
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.001
Cloning of NADMDH Gene in Loquat Fruit and the Construction of Plant Expression Vector-
KOU Yan, YANG Jun, GAO Huanhuan, CHEN Xu, GUO Ao, ZHENG Guohua*
（College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Storage Science and Technology ofHorticultural Products, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China）
Abstract： In order to explore the accumulation and degradation mechani of malic acid in loquat fruit, the gene sequence of the open reading frame of NADMDH was obtained from the transcriptome of loquat fruit. By taking Jiefangzhong （the highacid variety of loquat） and Baili （the lowacid variety of loquat） as the materials, the total RNA was extracted from the fruit, and the NADMDH gene of malate synthetase in loquat fruit was cloned by RTPCR, and then the fluorogenic quantitative PCR analysis was conducted. The results showed that the open reading frame （ORF） of the NADMDH gene of malate synthetase in loquat fruit was 996 bp, encoding 332 amino acids. The fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene expression of NADMDH was the highest in Jiefangzhong and Baili at 95 d after flowering, while the NADMDH gene showed significant difference between the highacid and lowacid varieties at 80-105 d after flowering. The plant expression vector EjNADMDHPBI121 was succesully constructed by the seamless cloning technology, and then was introduced into the agrobacterium tumefaciens EHA105 to obtain the engineering bacteria for plant tranormation, which laid a foundation for the later use of transgenic technology to improve the quality and genetic improvement of loquat fruit.
Key words： Loquat; NADMDH gene; Gene cloning; Expression analysis; Vector construction
枇杷是我国的原产果树,其产量、面积均居世界第一[1].枇杷果肉柔软多汁,风味独特,并且具有润肺、 止渴等作用,一直以来都深受人们喜爱.枇杷果实成熟时期在春末夏初,此时正值水果淡季,因此具有较强的市场竞争力[2].枇杷果实酸度偏高是影响其效益的主要问题,果实中有机酸的种类及质量分数是影响果实品质的重要因素之一[3].根据水果果实在成熟过程中有机酸的积累可以分为3种类型：柠檬酸型、苹果酸型、酒石酸型,枇杷果实属于苹果酸型的水果[4].虽然枇杷果实中调控酸性的性状基因是一对主效基因（Ma/ma）,但其果实中苹果酸的积累还需要通过苹果酸代谢来实现,cyNADMDH基因是调控苹果酸合成途径的关键基因[5].王鹏飞[6]从欧李果实的转录组中克隆出MDH基因,其研究结果表明MDH基因表达量差异是高低酸品种间苹果酸积累差异的重要原因之一.姚玉新等
2结果与分析
2.1枇杷果肉总RNA的提取
枇杷果肉总RNA经1%的琼脂糖电泳检验其完整性,结果如图1.从图1可以看出,RNA条带完整,18S和28S主条带清晰,且无DNA的污染,表明提取的总RNA质量良好,可用于后续反转录合成质量较好的cDNA.
2.2枇杷NADMDH基因的ORF克隆
以枇杷果实中的RNA为模板,设计1对引物MDHF和MDHR为上下游引物进行PCR扩增,获得了与预期片段大小一致约996 bp条带（图2）,将PCR产物回收并进行连接转化,挑取白色菌落进行PCR鉴定,将鉴定为阳性的3个克隆子送华大基因生物有限公司测序,测序结果表明克隆的EjNADMDH基因ORF为996 bp,编码332个氨基酸（图3）,利用NCBI中Blast对序列进行同源检索,表明此序列与其他已登陆的苹果、李、梨的NADMDH基因同源性高达95%～100%,将该基
2.3EjNADMDH基因编码的蛋白质的生物信息
利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）翻译所得NADMDH基因序列,得到的结果为NADMDH基因共编码332个氨基酸残基,理论上的蛋白分子量35.61 kD,理论等电点为6.01,分子式为C1573H2533N433O478S14.其中,负电荷残基数为36个,正电荷残基数为32个,枇杷NADMDH蛋白的不稳定系数为33.08（<40）,属于稳定蛋白.EjNADMDH基因编码蛋白的疏水性分析结果表明,疏水性最大值为1.800,最小值为-2.891,其大部分区域为亲水区（图4A）.采用NCBI数据库BLAST对编码蛋白结构域进行预测,得出MDH基因与其家族基因具有很高的特征序列（图4B）,对于MDH蛋白进行二级结构预测时采用了SOPMA程序,其结果表明NADMDH基因主要由α螺旋、β转角、延伸链、无规则卷曲四者组成,所占比例分别为45.18%、4.52%、16.87%和33.43%（图4C）.采用swisodel对NADMDH蛋白的结构进行预测,表明与4mdhB模型相似度高达80%（图4D）.
2.4EjNADMDH蛋白质的氨基酸同源性及系统发育分析
将NADMDH基因编码的氨基酸提交到NCBI中的blast与蔷薇科植物的NADMDH基因编码的蛋白质进行比对分析（图5）,结果表明枇杷NADMDH蛋白与蔷薇科的植物苹果、欧李、白梨等的同源性高达80%以上.在同源性的基础上运用MEGA 7软件构建系统进化树（图6）,可以看出枇杷与苹果、白梨、欧李、甜樱桃等亲缘关系较近,但与番茄和胡杨关系较远.
2.5NADMDH基因植物表达载体的构建
分别使用Xba I和Sca I限制性内切酶酶切检测正确的质粒PBI121,产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳后表明酶切成功（图7）,回收PBI121的线性片段,按照InFusion试剂盒的操作说明将质粒的线性片段与带有同源15 bp的目的基因进行基因重组,对转化后的菌液进行PCR检验,与预期结果一致,得到996 bp的片段（图8）,送华大基因生物有限公司进行检测,结果序列正确,表明载体EjNADMDHPBI121构建成功.
2.6NADMDH基因的定量表达分析
利用荧光定量对枇杷果实生长发育过程中的NADMDH基因进行定量分析,由图9可知,解放钟和白梨果实中NADMDH基因表达量有着相似的趋势,均呈现先升高降低再升高降低的趋势.解放钟NADMDH基因的表达量较白梨的波动趋势大,两者都呈现锯齿状波动.在盛花期后95 d NADMDH基因在两个枇杷品种中的表达量最高,分别为7.14和3.82;在花后80 d之后解放钟NADMDH的表达量明显高于白梨的表达量.
3讨论
植物细胞中含有多种类型的苹果酸合成酶如NADMDH和NADPMDH等,其中NADMDH主要参与三羧酸循环,是苹果酸代谢过程中合成苹果酸的关键酶之一[9].近年来,前人对蔷薇科果树的MDH基因进行了广泛的研究.Yao等[10]从苹果果实克隆了cyMDH基因的全长,其保守序列996 bp,编码了332个氨基酸,并且通过转基因技术验证了MdMDH与苹果酸的合成有着密切的联系.田丽[11]从郁李的果实中分离克隆出NADMDH基因的保守序列872 bp,与苹果、桃的MDH基因相似性为98%和95%.本研究從枇杷果实转录组数据中筛选出EjNADMDH家族中表达量较高的EjNADMDH基因,运用RTPCR技术克隆EjNADMDH基因的保守区序列长度为996 bp,编码了332个氨基酸,蛋白分子量为35.61 kD,理论等电点为6.01,分子式为C1573H2533N433O478S14.EjNADMDH蛋白属于亲水性蛋白.通过进化树分析,EjNADMDH基因与其他物种的同源性很高,表明EjNADMDH基因在进化上具有高度的保守性[12].
利用荧光定量PCR对2个枇杷果实的NADMDH基因在发育阶段的表达进行检测,采用Livak等[13]的2-ΔΔCT的方法对结果进行分析,结果表明高酸和低酸枇杷品种的NADMDH基因表达量具有相似的波动趋势,两个品种在花后（即果实成熟前）50～80 d时NADMDH基因的表达量很低,花后95 d（即果实成熟时）两个品种的基因表达量达到最高,果实成熟后表达量降低但波动趋势小.高酸（解放钟）枇杷的NADMDH基因在果实发育过程中的表达量与低酸（白梨）枇杷的表达量存在显著差异,表明NADMDH基因在两个品种酸度差异中起到重要的调控作用.
将分离克隆的目的基因转化到宿主基因组中,是基因工程的一项基本技术.植物表达载体是将目的基因转化宿主细胞的重要媒介,载体构建是通过遗传转化方法开展基因功能鉴定的重要环节[14].分析不同载体构建的方法,表明现在的主流构建载体的方式是Gateway技术,预测未来载体构建的发展趋势将是无酶连接[15-19].韩凯等[19]对传统的构建方法、Gateway和采用无缝克隆构建载体的技术进行分析,从操作步骤、成本和时间等多方面进行综合比较,表明采用无缝克隆技术构建的方法具有更高的优势.本研究使用无缝克隆技术[20],成功构建了EjNADMDHPBI121表达载体,并采用冻溶法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.下一步将携带EjNADMDHPBI121的农杆菌转入番茄等作物,为进一步研究EjNADMDH基因的功能奠定基础.
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（責任编辑：林玲娜）
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植物和基因克隆引用文献:
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