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主题:基因克隆和木薯 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-03-24

基因克隆和木薯论文范文

《木薯ETR1基因克隆与表达分析》

本文是基因克隆和木薯类有关硕士论文开题报告范文与基因克隆类论文例文.

摘 要:【目的】克隆木薯乙烯受體基因(MeETR1)并检测其在木薯采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究ETR基因家族在木薯PPD过程中的功能作用提供参考依据.【方法】以木薯品种华南8号为材料,应用PCR扩增MeETR1基因编码区(CDS)序列,采用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、保守结构域及二、结构等进行预测分析,通过亚细胞定位确定MeETR1蛋白在植物细胞中的表达分布,并利用实时荧光定量PCR检测MeETR1基因在木薯采后PPD过程的表达情况.【结果】克隆获得MeETR1基因CDS序列全长2220 bp,共编码739个氨基酸,蛋白分子量为82.88 kD,理论等电点(pI)为6.76;MeETR1基因编码蛋白属于疏水蛋白,含有ETR1家族4个典型模块,即GAF结构域、HisKA结构域、HATPase_c结构域和REC结构域;其二级结构中α-螺旋占47.43%、延伸链占14.46%、无规则卷曲占38.11%.MeETR1氨基酸序列(XP_021625986.1)与同属大戟科的蓖麻(Ricinus communis)ETR1氨基酸序列(XP_002533252.1)相似性为92.42%,亲缘关系较近;MeETR1蛋白定位在细胞质中.与0 h(PPD前)相比,MeETR1基因的相对表达量在木薯采后PPD过程中(12、24、48和96 h)均呈显著下降趋势(P<0.05),即MeETR1基因表达受木薯采后PPD过程的抑制.【结论】MeETR1基因编码蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域,与其他植物ETR1在生物学功能上具有一致性;MeETR1基因表达在木薯采后PPD过程中受抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.

关键词: 木薯;乙烯受体(ETR);MeETR1基因;生理性变质(PPD);表达分析

中图分类号: S533.01 文献标志码: A 文章编号:2095-1191(2020)01-0019-08

Abstract:【Objective】In this study, the cassa ethylene receptor gene named MeETR1 was cloned and its expression level during the post-harvest physiological deterioration(PPD) process of cassa was detected, which laid a foundation for studying the function of the ETR gene family in cassa PPD process. 【Method】The coding region(CDS) of MeETR1 gene was amplified from cassa variety SC8 by PCR method, and the physicochemical properties, hydrophili-city/hydrophobicity, conserved domains, secondary and tertiary structures, and phylogenetic relationship were analyzed by bioinformatics method. The distribution of MeETR1 protein in plant cells was determined by subcellular localization, and the expression pattern of MeETR1 gene in PPD process was detected by qPCR. 【Result】The CDS of MeETR1 gene was 2220 bp in length and encoded 739 amino acids. The protein molecular weight was 82.88 kD, and the theoretical isoelectric point (pI) was 6.76. MeETR1 gene encoded protein was hydrophobin and contained four typical modules of the ETR1 family, namely GAF domain, HisKA domain, HATPase_c domain and REC domain. In the secondary structure, the α-helix accounted for 47.43%, the extended chain accounted for 14.46%, and the irregular coil accounted for 38.11%. The amino acid sequence of MeETR1 (XP_021625986.1) was 92.42% similar to the amino acid sequence of Ricinus communis ETR1 (XP_002533252.1), which had the close genetic relationship. Subcellular localization proved that MeETR1 was localized in the cytopla. The relative expression level of MeETR1 showed a significant declined trend during PPD process(12, 24, 48 and 96 h)(P<0.05) compared with 0 H(before PPD), indicating MeETR1 gene was inhibited by cassa PPD process. 【Conclusion】The protein encoded by MeETR1 gene contains four typical domains including GAF, HisKA, HATPase_c and REC, and its biological function is consistent with other plant ETR1. MeETR1 gene is inhibited during the cassa PPD process and might play a negative role in regulating PPD of cassa storage roots.

Key words: cassa; ethylene receptor(ETR); MeETR1 gene; post-harvest physiological deterioration(PPD); expression analysis

Foundation item: National Natural Science Foundation of China(31801419);General Program of Hainan Natural Science Foundation(317036);Hainan Graduate Student Innovation Research Project(Hys2018-34)

0 引言

【研究意義】木薯(Manihot esculenta)是大戟科木薯属植物,具有抗旱、耐瘠薄、适应性广及块根淀粉含量高等特点(张鹏等,2014),但木薯块根极不耐贮藏,采收后2~3 d即出现严重的生理性变质(Post-harvest physiological deterioration,PPD),也就是木薯块根维管束出现褐变,且随贮藏时间的延长而不断加剧(Zidenga et al.,2012;Xu et al.,2013),严重制约了木薯产业的可持续发展.乙烯(Ethylene)是一种气态的植物激素,其介导的信号通路在植物生长发育及逆境胁迫应答过程中发挥重要调节作用(Hershkovitz et al.,2009;施怡婷和杨淑华,2016;赵赫等,2016;Ren et al.,2017).乙烯受体蛋白(ETR)是乙烯信号转导途径中的关键元件之一,在调控植物生长发育及抵御逆境胁迫等过程中扮演重要角色(Zhou et al.,2007;Gao and Schaller,2009;Bisson and Groth,2010).因此,对木薯乙烯受体ETR基因(MeETR)进行研究,可为揭示ETR在木薯PPD过程中的作用机制提供科学依据.【前人研究进展】乙烯受体根据其蛋白结构的不同,可分为ETR I家族受体和ETR II家族受体.ETR基因最先从拟南芥中克隆获得(Gamble et al.,1998),之后相继从橡胶树(张桂和,2002)、香蕉(贺立红等,2009)、水稻(黄溪,2016)和番茄(苏丽艳,2019)等多种植物中克隆出多个家族成员,并证实了其在调控植物生长发育及抵御逆境胁迫中的功能作用.张桂和(2002)发现不同品种的橡胶树在经乙烯处理后其HbETR1基因表达呈明显的增加趋势,说明橡胶树对乙烯利刺激的反应较敏感;魏绍冲等(2004)研究发现猕猴桃AdETR1基因在果实成熟过程中上调表达,说明AdETR1基因与果实成熟有关;谢永红等(2005)研究表明,桃ETR1基因cDNA合成受温度和赤霉素(GA3)的调节,而乙烯的合成能力随ETR1基因表达量的上调而上升,即ETR1基因与乙烯合成有关;贺立红等(2009)发现38 ℃热处理能抑制香蕉MaETR1基因在果皮中的表达,而低温处理可促进MaETR1基因在果皮中的表达;郝金凤等(2012)通过分析甜瓜Cm-ETR2基因发现,Cm-ETR2基因在果实生长过程中的表达不断增强,并证实其能延长果实的贮藏时间;李丽秀和赖钟雄(2013)研究证实枇杷EjETR1a和EjETR2a基因在植株的生长发育及成熟衰老过程中起调控作用;黄溪(2016)通过研究水稻OsETR4基因发现,OsETR4基因在低温胁迫下其表达量上升,进而增强水稻在发芽期及苗期的耐冷性;田晓岩等(2017)研究发现文心兰时空特异性表达OnERS1基因与花衰老有关;李丽等(2018)研究表明芒果MiETR1基因参与果实成熟和衰老过程,并证实MiETR1能延长果实的贮藏时间;苏丽艳(2019)从番茄克隆获得SlETR6基因,且证实该基因参与番茄生长发育过程中的逆境调控.【本研究切入点】上述研究结果均表明,ETR1基因家族在植物生长发育及逆境胁迫的应答中发挥重要作用,但至今有关MeETR1基因在木薯采后PPD过程中的作用机制尚无研究报道.【拟解决的关键问题】以木薯品种华南8号为材料,结合木薯全基因组和转录组数据,对MeETR1基因进行克隆及生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在木薯采后PPD过程中的相对表达量,为研究ETR基因家族在木薯PPD过程中的功能作用提供参考依据.

1 材料与方法

1. 1 试验材料

木薯品种华南8号由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供.多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒及pMD18-T载体购自天根生化科技(北京)有限公司,反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司,2×Taq MasterMix、ChamQ Universal SYBR RT-PCR MasterMix试剂盒及大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司,农杆菌3101感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司,限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher Scien-tific公司,亚细胞定位载体pNC-Green-SubN和Nimble Cloning试剂盒购自海南壹田生物科技有限公司.主要仪器设备:超微量紫外分光光度计(Thermo,美国),PCR仪(耶拿,德国),EPS300电泳仪(Tanon,上海),CT15RT高速冷冻离心机(TECHCOMP,中国),4100凝胶成像仪(Tanon,上海),FluoView FV1000激光共聚焦显微镜(奥林巴斯,日本),MX3000荧光定量PCR仪(安捷伦,美国).

1. 2 材料处理

选取外表皮无破损的木薯块根,将其切下3~4片直径在4 cm左右的块根切片摆放在托盘中,置于温度26 ℃、相对湿度75%、光周期16 L∶8 D的培养箱中,分别在贮藏0、12、24、48和96 h等时段取出木薯块根,所有样品均经液氮冻存后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用.

1. 3 木薯总RNA提取及反转录

参照多糖多酚植物总RNA提取試剂盒提取不同时段的木薯块根RNA,采用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并以超微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度.使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA,用于后续基因克隆及表达分析.

1. 4 基因克隆与载体构建

结合木薯全基因组数据及本课题组前期的转录组数据,根据MeETR1基因编码区(CDS)序列设计引物MeETR1-F和MeETR1-R(表1),以木薯块根cDNA为模板进行PCR扩增.PCR反应体系25.0 μL:2×Taq MasterMix 12.5 μL,上、下游引物(MeETR1-F和MeETR1-R)各1.0 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O补足至25.0 μL.扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 160 s,进行30个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.符合预期大小的目的片段用DNA回收纯化试剂盒进行回收纯化,然后连接至pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,37 ℃培养16 h,挑选单菌落进行菌液PCR检测,阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,提取测序正确的阳性克隆质粒并保存用于后续研究.

1. 5 生物信息学分析

使用DNAMAN 6.0对MeETR1基因序列进行比对分析,通过EXPASY数据库(http://web.expasy.org/protparam/)分析其推导氨基酸序列的理化性质,以EMBNET数据库分析其跨膜结构,运用CD-Search进行保守结构域分析;分别利用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS-MODEL(https://swisodel.expasy.org/)对其编码蛋白的二、结构进行预测分析;采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索及比对分析同源序列,并以MEGA 7.0中的Neighbor-joining法构建系统发育进化树.

1. 6 亚细胞定位

根据MeETR1基因CDS序列设计引物(表1),以阳性克隆质粒为模板进行扩增,扩增产物经切胶回收纯化后使用Nimble Cloning MIX试剂将其连接至pNC-Green-SubN表达载体中,构建植物表达载体pNC-Green-SubN-MeETR1,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,37 ℃培养14 h,挑菌、摇菌后进行菌液PCR鉴定,将阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序.经测序比对分析后,选取测序正确的阳性克隆质粒转化农杆菌3101感受态细胞,使用瞬时转化法分别将pNC-Green-SubN-MeETR1和空载pNC-Green-SubN(对照)转入到烟草叶片中.25 ℃培养48 h后选取侵染的叶片制作切片,通过FluoView FV1000激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况.

1. 7 基因表达分析

以木薯TUB基因为内参基因,根据MeETR1基因CDS序列设计引物QMeETR1-F和QMeETR1-R(表1),通过实时荧光定量PCR检测MeETR1基因在木薯采后PPD过程中的表达情况.实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL:荧光染料Mix 10.0 μL,正、反向引物(QMeETR1-F和QMeETR1-R)各0.4 μL,cDNA模板1.0 μL,ddH2O补足至20.0 μL.扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,进行40个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.每个样品进行3次生物学重复,使用2-△△Ct法换算MeETR1基因的相对表达量(颜彦等,2018).

2 结果与分析

2. 1 MeETR1基因克隆结果

以MeETR1-F和MeETR1-R为引物、木薯块根cDNA为模板,PCR扩增获得一条约2000 bp的目的基因条带(图1),经回收纯化、连接至pMD18-T载体及转化DH5α感受态细胞后,挑选阳性克隆进行测序,证实得到目的基因即为MeETR1基因(cassa4.1_002375m.g),其CDS序列为2220 bp,编码739个氨基酸.

2. 2 MeETR1蛋白理化性质预测分析结果

MeETR1蛋白分子量为82.88 kD,理论等电点(pI)为6.76,原子总数为11819,化学式为C3727H6001N1003 O1050S38;其氨基酸成分中亮氨酸[Leu(L)]、缬氨酸[Val(V)]和丙氨酸[Ala(A)]的含量较高,分别占13.4%、9.3%和7.3%;蛋白脂肪系数为109.95,不稳定系数值为45.64,属于不稳定蛋白.使用ProtScale预测MeETR1蛋白的亲/疏水性,结果(图2)表明,MeETR1蛋白的最大亲水性为-2.767、最大疏水性为2.611,有82个氨基酸亲水数峰在-1.000以下,有150个氨基酸疏水数峰在1.000以上,亲水性氨基酸数目明显少于疏水性氨基酸,为疏水蛋白.通过CD-Search预测MeETR1蛋白保守结构域和功能域,发现MeETR1蛋白包括4个典型模块,即GAF结构域、HisKA结构域、HATPase_c结构域和REC结构域(图3).

2. 3 MeETR1蛋白二、结构预测结果

使用PRABI对MeETR1蛋白二级结构进行预测,结果(图4)表明,MeETR1基因编码蛋白二级结构中有351个α-螺旋(占47.43%)、107个延伸链(占14.46%)及281个无规则卷曲(占38.11%).以SWISS-MODEL预测MeETR1蛋白结构,其结果(图5)与二级结构预测结果一致.

2. 4 MeETR1氨基酸序列同源比对分析及系统发育进化树构建

利用NCBI搜索与MeETR1氨基酸同源的氨基酸序列[蓖麻(Ricinus communis)、毛果杨(Populus trichocarpa)、梅(Prunus mume)、草莓(Fragaria x ananassa)、月季(Rosa chinensis)、龙眼木(Dimocarpus longan)、柑橘(Citrus sinensis)、芒果(Mangifera indica)、猕猴桃(Actinidia deliciosa)、葡萄(Vitis vinifera)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)],进行多序列比对分析(图6),并使用MEGA 7.0中的Neighor-joining法构建基于ETR1氨基酸序列相似性的系统发育进化树(图7),结果显示,MeETR1氨基酸序列(XP_021625986.1)与同属大戟科的蓖麻ETR1氨基酸序列(XP_002533252.1)相似性为92.42%,且位于同一进化分支上,即MeETR1与蓖麻ETR家族的亲缘关系较近;与毛果杨(XP_002299688.1)、梅(XP_008218930.1)、草莓(CA8384.1)、月季(XP_024181357.1)、龙眼木(ACL81480.3)、柑橘(KDO50509.1)、芒果(AIT39449.1)、猕猴桃(ABY 28264.1)、葡萄(CAN73257.1)的ETR1氨基酸序列相似性分别为88.77%、88.26%、87.85%、88.12%、88.39%、87.58%、86.52%、86.27%和85.70%,亲缘关系相对较远;与拟南芥(NP_176808.3)的ETR1氨基酸序列相似性为83.15%,亲缘关系最远.

2. 5 MeETR1蛋白亚细胞定位分析结果

将MeETR1基因CDS序列连接至携带有GFP荧光蛋白的pNC-Green-SubN表达载体中,成功构建了pNC-Green-SubN-MeETR1植物瞬时表达载体;然后以农杆菌注射侵染烟草叶片的方式进行亚细胞定位试验,观察GFP荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况,结果(图8)显示经pNC-Green-SubN-MeETR1侵染的烟草叶片在细胞质中出现明显的绿色荧光信号,表明MeETR1基因編码蛋白表达定位于细胞质中.

2. 6 MeETR1基因表达分析结果

MeETR1基因在木薯采后PPD过程中不同时段的表达情况如图9所示.与0 h(PPD前)相比,MeETR1基因的相对表达量在PPD过程中(12、24、48和96 h)均呈显著下降趋势(P<0.05),表明MeETR1基因表达受木薯采后PPD过程的抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.

3 讨论

ETR是乙烯信号转导途径中一类包含多个基因的关键组分,其蛋白结构及基因时空表达方面各不相同,因此其家族成员在逆境胁迫中可能具有多种调控模式,在不同胁迫条件下ETR基因的调控模式存在明显差异(Gao and Schaller,2009;Bisson and Groth,2010).根据蛋白结构的不同通常将ETR分为两个亚家族,其中,亚家族I受体(ETR1和ERS1)具有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域;亚家族II受体包括ETR2、ERS2和EIN4,其在N-末端具有额外的信号肽,且与亚家族I受体相比具有分叉的His激酶结构域(Yang et al.,2015).ETR1参与植物生长发育及抵御逆境胁迫的多个过程,目前已从甜瓜、芒果和番茄等植物中克隆获得ETR1基因,但关于MeETR1基因在木薯采后PPD过程中的功能作用研究尚无报道.本研究成功克隆获得ETR1亚家族成员MeETR1基因的CDS序列,其长度为2220 bp,共编码739个氨基酸,含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域;多序列比对分析发现MeETR1氨基酸序列与多个物种的ETR1氨基酸序列相似性较高,均在80.00%以上,表明不同植物的ETR在生物学功能上可能具有一致性(李丽等,2018).MeETR1基因编码蛋白定位于细胞质中,与拟南芥ETR1基因编码蛋白定位在内质网上(Chen et al.,2002;Dong et al.,2008)有所不同,可能是用于侵染的植物不同所致(Dong et al.,2010),因此后续有待利用原生质体重新进行亚细胞定位分析.

ETR1作为乙烯信号转导途径的元件之一,在乙烯信号转导过程中能直接与乙烯结合形成受体复合物,即ETR1在乙烯信号转导途径中发挥重要作用,因此MeETR1基因在木薯中的功能可能与其他植物ETR基因相似.本研究通过实时荧光定量PCR检测分析MeETR1基因在木薯采后PPD过程中不同时段的表达谱,结果发现MeETR1基因在0 h(PPD前)的相对表达量最高,在PPD过程中(12、24、48和96 h)其相对表达量均呈显著下降趋势,推测MeETR1基因在木薯采后PPD过程中具有负调控作用.在今后的研究中可通过构建MeETR1基因过表达及干扰转基因株系进一步解析MeETR1基因在木薯块根采后PPD过程中的功能.

4 结论

MeETR1基因编码蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域,与其他植物ETR1在生物学功能上具有一致性;MeETR1基因表达在木薯采后PPD过程中受抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.

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(責任编辑 兰宗宝)

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