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主题:提取 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-02-12

提取论文范文

《质粒DNA提取方法进展》

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摘 要:在生物实验中,质粒DNA常常作为基因载体运载工具使用,应用非常广泛,质粒DNA的提取通常在实验室内进行,保证其提取的效率和质量对生物实验研究具有重要意义,基于此本文对质粒DNA的提出方法进行了探讨.

关键词:质粒DNA;提取方法;研究

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子.在基因工程领域,质粒常常被当做基因的载体使用.在分子生物学中,质粒DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用.在质粒DNA的应用过程中,其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响,因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率.

在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步,培养细菌,使质粒扩增;第一步,进行细菌的收集和裂解;第三步,质粒DNA的分离和纯化.在质粒DNA的提取过程中,其提取效果和其大小呈现出正比例关系,越小越容易进行提取,这主要是由于,如果质粒DNA比较大的话,其特性机会和染色体DNA比较接近,这样想要将二者分离开来难度就会变大.在进行质粒DNA的分离时,适宜的条件是非常重要的,主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等,在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA才能够更好的分离开来.细菌浓度对于质粒DNA的提取也是非常重要的,如果细菌的浓度比较高,那么在溶菌时,溶菌液很难和细菌液充分混合,导致溶菌不彻底的问题,这样会造成质粒的回收率比较低;而如果细菌溶度比较低,溶菌液和菌液均分混合,会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片,在这样的情况下,沉淀时质粒回合这些物质共沉,进而导致质粒的回收率也会比较低.在生物学的相关研究之中,细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作,主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等,下面对这些方法的最新研究进行介绍.

1 碱裂解法

碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒DNA提取方法,这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高,操作便捷,缺点是需要较长的提纯时间.研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究,但是没有得到理想的效果,当前这一方法提取DNA的时间都在1.5h以上.碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选,在菌液中加入溶液Ⅰ,使细菌细胞悬浮,同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+螯合,起到抑制DNase活性的作用;然后,加入溶液Ⅱ,将细胞裂解,在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质;再次,加入溶液Ⅲ,使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀,并使得质粒DNA复性.其中,该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH,正因如此该方法被称为碱裂解法,如果将其换为SDS,也能够提取出少量的质粒DNA,这是由于SDS也是碱性的,可以一定程度上破坏细菌的细胞膜.在这一方法中需要注意,NaOH溶液要现用现配,这个主要是由于其能够和空气中的CO2反应,从而使溶液的碱性降低,这样会影响提纯的效率,另外在加入溶液Ⅱ之后,操作时间不能够过长,这是因为染色体DNA在碱性条件下片段会慢慢断裂.另外需要注意的是,在操作过程中,混匀是一定要轻柔,从而在保证细菌沉淀可以充分的扩散在试剂中的前提下,避免已变性质粒DNA和染色体基因组DNA被机械剪切.此外,在溶液Ⅲ加入之后,其中的SDS会和蛋白质结合,会产生大量的沉淀,SDS还会和醋酸钾结合,生成PDS,这一物质的溶解度远低于SDS,从而可以将大部分蛋白质和染色体DNA共沉淀.

2 煮沸法

煮沸法的优点在于,能够在高菌体浓度的条件下进行质粒DNA的提取,应用这种方法可以是菌体裂解液浓度达到OD600等于100,能够达到碱裂解法的2.5倍.在进行质粒的提取时,提高提取效率十分重要,因此需要更提高处理样品的能力.在提取時,同一时间内,最好处理尽可能多的菌体,而菌体浓度比较高的情况下,可能会导致裂解不充分的问题,并增加后续操作的难度,影响到质粒DNA的提取效率和质量.通过煮沸法则可以有效的解决这一问题,这是特点也是煮沸法的主要优势所在.在传统的煮沸法中,裂解通常在100℃的热水浴中进行,如果温度过高的话,不仅难以控制好温度,同时会浪费比较多的能源.研究人员对煮沸法进行了优化,在连续热裂解方法中,增加了37℃温浴这一步骤,在热裂解之前先37℃温浴20min,在这样的条件下,裂解缓冲液中的溶菌酶以及Triton-X100可以充分的和菌体进行通,在这样的条件下,可以降低热裂解的温度,只需要70℃就可以满足要求,温度更加容易控制,而且能够节约能源.

3 SDS裂解法

SDS裂解法中,需要应用到3种裂解溶液,每种溶液的作用各不相同.其中,溶液Ⅰ的作用是对反应的pH值进行控制,通过控制pH值来使细胞壁溶解,从而增加细胞比重,从而使细胞悬浮起来;溶液Ⅱ的主要作用是使长链基因组DNA变性,并使其和蛋白质、细胞碎片等相互缠绕,最终形成大型的复合物,SDS会将这一复合物包覆起来,在这一过程中部分超螺旋的闭环环状质粒DNA也会出现可逆变性;在加入溶液Ⅲ之后,该溶液能够使整个系统恢复中性条件,从而使出现可逆变性的质粒DNA复性,同时接入溶液Ⅲ后,SDS还会和其中的醋酸钾出现反应,生成溶解度较低的PDS,从而使SDS包覆的大型复合物沉淀,离心之后就可以分离出质粒DNA.

4 结论

碱裂解法、煮沸法和SDS裂解法是比较常规的质粒DNA提取方法,其中,碱裂解法的特点是操作简便,提出的质粒DNA纯度较高,具有较高的提取效率,因此应用的比较广泛,应用此方法提取出的质粒DNA被广泛应用转化细菌、酶切分析以及DNA重组实验中;煮沸法则由于过程比较剧烈,容易导致质粒DNA结构的破坏,其优点是可以处理高浓度的菌液;SDS裂解法具有良好的提出纯度.

参考文献:

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[2]李卫玲,易初丽.质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展[J].江汉大学学报(自然科学版),2018,46(1):62-66.

[3]李恒.大肠杆菌质粒DNA提取方法的研究[J].资源节约与环保,2018,199(6):86.

作者简介:王佩菡(1997-),女,回族,山东济宁人,本科三年级,研究方向:健康科学.

总结:此文为一篇关于对不知道怎么写质粒和方法和进展论文范文课题研究的大学硕士、提取本科毕业论文提取论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料.

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