《产漆酶细菌筛选鉴定与固体发酵条件》
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摘 要为了获得能降解木质素的细菌,采用愈创木酚法和BR亮蓝平板法从枯枝落叶自然堆积物中分离漆酶活力较高的菌株,通过形态学观察、生理生化试验,16S rRNA序列分析及系统发育树的构建对菌株进行鉴定.以芦苇秸秆粉为主要原料,采用单因素试验和正交试验研究并优化了菌株适宜的发酵培养基和发酵条件.结果表明,菌株H-1鉴定为蜡状芽孢杆菌H-1（Bacillus cereus H-1）;适宜的发酵培养基和发酵条件为芦苇粉100%,（NH4）2SO4 2.5%,酵母抽提粉0.3%,KH2PO4 0.15%,MgSO4·7H2O 0.15%,NaCl 0.5%,CaCl2 0.1%,发酵温度35 ℃,固水比1.0∶1.1（g∶mL）,初始pH 7.2～7.4,接种量3%,装量50 g,发酵时间144 h.在此条件下,漆酶活力达0.992 U/g.
关键词芦苇秸秆;蜡状芽孢杆菌;漆酶;固体发酵
中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2020）01-0001-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.001
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Screening and Identification of Laccaseproducing Bacteria and Study on Solidstate Fermentation Conditions
TAN Yelin,DU Quanneng,ZHU Wenjuan et al
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128）
AbstractIn order to obtain lignindegrading bacteria, the strains with high laccase activity were isolated from natural litter by guaiacol and BR brilliant blue plate method which were identified by morphological observation, physiological and biochemical experiments, 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The suitable fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized by single factor and orthogonal experiments with reed straw powder as the main raw material. The results showed that strain H1 was identified as Bacillus cereus H-1. The suitable fermentation medium and conditions were as follows： reed powder 100%, （NH4）2SO4 2.5%, yeast extract powder 0.3%, KH2PO4 0.15%, MgSO4·7H2O 0.15%, NaCl 0.5%, CaCl2 0.1%, fermentation temperature 35 ℃, solidwater ratio 1.0∶1.1（g∶mL）, initial pH 7.2-7.4, inoculation volume 3%, loading capacity 50 g, fermentation time 144 h. Under those conditions, laccase activity reached 0.992 U/g.
Key wordsReed straw;Bacillus cereus;Laccase;Solidstate fermentation
木質素主要存在于木材和各种秸秆中,全世界每年产量约1 500亿t,它是一种取之不尽,用之不竭的绿色再生资源[1].其结构复杂,主要是由5-羟基松柏醇、对香豆醇、芥子醇和松柏醇等组成的酚类聚合物[2].由于木质素与半纤维素、纤维素之间相互混杂和交联,且将纤维素包埋其中[3-5],导致纤维素难以被降解或降解效率低.木质素的降解方法主要包括物理法[6-7]、化学法[6,8]、物理化学法[9-10]和微生物法[11-12].其中微生物法以其反应条件温和、设备要求和成本低以及对环境友好等优点受到国内外许多科研工作者的高度重视.胡笑峰等[13]以碱木质素为唯一碳源从落叶覆盖的土壤中分离1株能够将木质素样品裂解成细小碎片的细菌Erwinia sp.QL-G3;张鹏飞等[14]从高温期堆肥中筛选到1株木质素降解率为28.47%的嗜热嗜脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）;Chen等[15]在竹腐蚀滑块的流体中培养丛毛单胞菌B-9,发现该菌能在木质素衍生物中生长;李红亚等[16]分离筛选到1株玉米秸秆木质素降解率可达24%的淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）.该研究拟从枯枝落叶自然堆积物中分离能高效降解木质素的菌株,采用形态学观察、生理生化试验和16S rRNA序列分析对菌株进行鉴定,并研究菌株适宜的漆酶产生条件,以期为高效利用芦苇纤维素生产生物乙醇提供科学依据.
1材料與方法
1.1材料
1.1.1土样采集.
菌种分离样品采自长沙市森林植物园枯枝落叶堆积且腐烂严重的土样,用无菌自封袋带回实验室立即进行菌种分离.
1.1.2主要仪器与设备.
MJ-160C细菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;SS-325高温高压灭菌锅（TOMY.KOGYO.CO,LTD）;SW-CJ-1B（U）单人单面超净工作台（苏州设备净化有限公司）;QYC 2112恒温振荡培养箱（上海福玛实验设备有限公司）;722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）.
1.1.3主要试剂.
牛肉膏、可溶性淀粉、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、FeSO4、CaCO3、FeCl3、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、D-甘露糖（AR,国药集团化学试剂有限公司）,KH2PO4（AR,西陇化工股份有限公司）,酵母抽提粉（BR,国药集团化学试剂有限公司）,蛋白胨（BR,上海胜思生化科技有限公司）等.
1.1.4培养基.
1.1.4.1斜面培养基.牛肉膏0.300%,蛋白胨1.000%,NaCl 0.500%,琼脂粉2.000%,pH 7.2～7.5.
1.1.4.2初筛培养基.蛋白胨0.500%,酵母抽提粉1.000%,葡萄糖2.000%,愈创木酚2.500 g/L,NaCl 0.500%,琼脂粉2.000%,pH 7.2～7.5.
1.1.4.3RB亮蓝培养基.胰蛋白胨1.000%,酵母抽提粉0.500%,NaCl 0.500%,RB亮蓝0.003%,琼脂粉2.000%,pH 7.2～7.5.
1.1.4.4复筛培养基.木质素1.000%,葡萄糖0.200%,（NH4）2SO4 0.500%,酵母抽提粉0.500%,KH2PO4 0.200%,MgSO4·7H2O 0.100%,MnSO4·4H2O 0.002%,CaCl2 0.010%,pH 7.2～7.5.
1.1.4.5
液体种子培养.葡萄糖2.000%,蛋白胨1.000%,酵母抽提粉0.500%,KH2PO4 0.200%,MgSO4·7H2O 0.100%,NaCl 0.500%,pH 7.2～7.5.
1.1.4.6
基础产酶培养基.芦苇粉100%,（NH4）2SO4 2.000%,酵母抽提粉0.500%,KH2PO4 0.200%,MgSO4·7H2O 0.100%,NaCl 0.500%,CaCl2 0.100%,固∶水等于1∶1（g∶mL）,pH 7.2.
1.1.4.7生理生化试验培养基.参照文献[17]提供的培养基配制.
1.2方法
1.2.1木质素分解菌的筛选.
将样品按照10倍稀释法稀释至10-3～10-6,吸取稀释液0.1 mL于初筛固体培养基平板,置于37 ℃电热恒温培养箱中培养至长出菌落.选择变成粉红色变色圈的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上并编号,37 ℃恒温培养箱中培养36 h,备用.
1.2.2漆酶产生菌的筛选.
将分离保存的菌种分别接种于RB亮蓝固体培养基平板,37 ℃恒温培养2 d,选择培养基褪色圈大的菌落进行复筛.
1.2.3漆酶产生菌复筛.
1.2.3.1
液体菌种培养.
将分离且在亮蓝培养基上褪色快的菌种分别接种于液体种子培养基中,37 ℃、150 r/min恒温振荡培养24 h,备用.
1.2.3.2菌种复筛.
按2%（V/W）的接种量接入基础产酶培养基中,37 ℃恒温培养5 d后,测定漆酶酶活.
1.2.4菌种鉴定.
1.2.4.1菌落和菌体形态特征观察.将菌株H-1接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上,37 ℃培养16～24 h,观察菌落和菌体形态特征.
1.2.4.2
生理生化特征鉴定.对菌株H-1进行需氧型、糖发酵、VP、吲哚、淀粉水解、硝酸盐还原等生理生化试验鉴定.
1.2.4.316S rRNA序列测定.
按SK8255试剂盒提取16S rRNA并测序分析,采用通用引物F27（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和R1492（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）对菌株H-1的16S rRNA进行PCR扩增,PCR扩增体系参照文献[18]提供的方法进行.测序结果利用NCBI提供的BLAST程序与数据库中的所有序列进行比对,利用MEGA 5.0构建系统发育树.
1.2.5培养.
1.2.5.1斜面培养.将保存于冰箱的斜面种子接种于新鲜斜面培养基上,37 ℃恒温培养至成熟,备用.
1.2.5.2液体种子培养.将培养的斜面菌种接种于液体种子培养基中,37 ℃、150 r/min条件下恒温振荡培养24 h,备用.
1.2.5.3发酵产酶培养.在300 mL三角瓶中装入50 g基础产酶培养基,接入2%（V/W）的液体种子,37 ℃恒温条件下培养5 d,期间每24 h摇匀1次.
1.2.6产酶条件研究.
分别改变培养基中碳源种类,（NH4）2SO4、酵母抽提粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O添加量以及固水比、初始pH、培养温度、接种量、装量和发酵时间等,研究其对漆酶酶活的影响.
结论:该文是关于细菌和筛选和鉴定和发酵和条件方面的鉴定论文题目、论文提纲、鉴定论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文.
鉴定引用文献:
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