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主题:抗氧化 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-03-01

抗氧化论文范文

《响应面法优化多穗石柯总黄酮提取工艺与抗氧化活性》

本文是抗氧化类有关学士学位论文范文跟响应面法和优化和多穗石柯和提取和工艺和活性方面大学毕业论文范文.

摘 要[目的]優化多穗石柯总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性的研究.[方法]运用单因素和响应面试验相结合,通过超声波辅助对其总黄酮的提取进行优化,利用响应面分析法考察料液比、提取温度、提取时间对其总黄酮含量的影响,并进行抗氧化活性分析.[结果]多穗石柯总黄酮最佳提取条件为超声功率328.8 W、超声频率35 kHz、乙醇浓度60%、料液比1∶41.2(g∶mL)、提取温度63.2℃、提取时间37.8min,总黄酮提取率为19.18%.抗氧化活性试验结果表明,当黄酮浓度为2mg/mL时,对·OH、DPPH·和O2-·的最大清除率分别为11.70%、75.86%和32.00%,并具有很好的还原能力.[结论]通过热溶剂浸提超声波辅助提取法提取多穗石柯中的黄酮类化合物,所用时间短、要求温度低、提取率好,方法简单易行,具有明显的优势.该研究采用响应面法确定该方法的最佳提取工艺,以期为多穗石柯产业化及开发新天然抗氧化剂提供理论依据.

关键词多穗石柯;响应面法;总黄酮;提取工艺;优化;抗氧化活性

中图分类号R284文献标识码A

文章编号0517-6611(2020)01-0181-05

doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.055

开放科学(资源服务)标识码(OSID):

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flonoids from Lithocarpus polystachyrus Rehd by Response Surface Methodology

TANG Jianmin,ZHU Chenghao,GAO Limei et al

(Guangxi Key Laboratory of Karst Plant Conservation and Restoration Ecology, Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin,Guangxi 541006)

Abstract[Objective]To optimize the extraction process and antioxidant activity of total flonoids from Lithocarpus polystachyrus.[Method]The combination of single factor and response surface test was used to optimize the extraction of total flonoids by ultrasonic assist,the effects of solidliquid ratio, extraction temperature and extraction time on the content of total flonoids were investigated by response surface analysis, and the antioxidant activity was analyzed.[Result]The optimal extraction conditions of total flonoids from Lithocarpus polystachyrus were ultrasonic power 328.8 W, ultrasonic frequency 35 kHz, ethanol concentration 60%, solidliquid ratio 1∶41.2(g∶mL), extraction temperature 63.2 ℃, extraction.At time 37.8min, the flonoid yield was 19.18%.The results of antioxidant activity test showed that when the concentration of flonoids was 2 mg/mL, the maximum clearance rates of ·OH, DPPH· and O2-· were 11.70%, 75.86% and 32.00%, respectively, and had good reducing ability.[Conclusion]Ultrasonic assisted extraction with hot solvent extraction is a simple and effective method for extraction of flonoids from Lithocarpus polystachyrus.In this study, the response surface method is used to determine the optimal extraction process of this method, so as to provide theoretical basis for the industrialization and the development of new natural antioxidants.

Key wordsLithocarpus polystachyrus Rehd;Response surface method;Total flonoids;Extraction process;Optimization;Antioxidant activity

多穗石柯(Lithocarpus polystachyrus Rehd),别名甜茶、甘茶、多穗柯或甜叶子树,为壳斗科石柯属常绿乔木,主要分布于我国长江以南各省区的低山密林中[1].多穗石柯是我国传统悠久的民族中药和保健饮品,药食同源植物之一;其味甘、性平,具有清热解毒、化痰、安神降压、补肾益阴等功效.作为民间茶饮,其茶液金黄,气味醇香,甘甜可口,是款待宾客的至上饮品,是人类追求具有茶、糖、药3种功能的理想饮料,具有巨大的开发前景[2-3].现代医学研究发现,多穗石柯中含有丰富的黄酮类、三萜类、多酚类等物质,具有抗氧化、降血压、降血糖、抗过敏等药理作用[4-5].鉴于对多穗石柯总黄酮类提取和抗氧化研究报道较少,该试验采用一种更合理的试验设计方法——响应面法[6-9],优化超声波提取技术对多穗石柯总黄酮提取工艺,通过响应面法对多穗石柯总黄酮含量进行测定,确定最佳提取工艺并利用其总黄酮进行体外抗氧化活性,从而为其进一步开发利用提供科学依据.

1材料与方法

1.1试材多穗石柯样品2018年10月采自于广西植物研究所喀斯特植物园,取其完整叶片、烘干、粉碎后过60目筛备用.样品经广西植物研究所蒋运生研究员鉴定.

1.2仪器与试剂

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);DL-720E智能超声波;电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司).芦丁标准品(批号:MUST-12040302,中国药品生物制品检定所);乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、铁、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、三氯化铁、邻苯三酚、邻二氮菲、PBS均为分析纯试剂,桂林卓一生物有限公司.

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的绘制.

精密称取真空干燥至恒重的芦丁标准品20 mg,乙醇溶解制成0.4 mg/mL的对照品溶液.

分别取制备好的对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL及提取液1 mL,置于25 mL容量瓶中;加50%乙醇至10 mL,加5%亚硝酸钠1 mL,混匀,静置6 min;加10%硝酸铝溶液1 mL,混匀,静置6 min;加4%氢氧化钠溶液10 mL,50%乙醇调至刻度,混匀,得空白液、对照品溶液及样品供试液;静置15 min后在190~900 nm处进行光谱扫描,确定选用510 nm作为测定波长.以吸光度为纵坐标、总黄酮浓度为横坐标绘制回归曲线,回归方程为y等于0.203 8x-0.007 8(R2等于0.999 2),总黄酮浓度在0.001 3~0.013 0 mg/mL线性关系良好.

1.3.2供试品溶液的制备.

称取样品粉末0.5 g,按照料液比为1∶48.5加100%乙醇24.5 mL,61.9 ℃水浴提取20 min,超声波频率为35 kHz,超声波功率为409.6 W,提取结束后过滤,洗涤液合并,定容至50 mL,即得供试品溶液.

1.3.3总黄酮提取工艺优化试验.

1.3.3.1单因素试验.

(1)超声频率对总黄酮提取率的影响.准确称取0.5 g样品粉末,按照料液比1∶20(g∶mL)加入50%乙醇10 mL,40 ℃水浴中提取30 min,超声功率为180 W,超声频率分别为高频(61 kHz)和低频(35 kHz),过滤,定容至50 mL,取1 mL至25 mL容量瓶中.

(2)超声功率对总黄酮提取率的影响.

准确称取样品粉末0.5 g,按料液比1∶20加入50%乙醇10 mL,40 ℃水浴中提取30 min,超声功率分别为60、180、300、420、540 W,超声频率为高频(61 kHz),过滤,定容至50 mL,按照“1.3.1”步骤加样,测定吸光度,计算总黄酮含量.

(3)提取温度对总黄酮提取率的影响.

准确称取样品粉末0.5 g,按料液比1∶20加入50%乙醇10 mL,分别在30、50、60、70、90 ℃水浴中提取30 min,超聲功率为420 W,超声频率为高频(61 kHz),过滤,定容至50 mL,按照“1.3.1”步骤加样,测定吸光度,计算总黄酮含量.

(4)乙醇浓度对总黄酮提取率的影响.

准确称取样品粉末0.5 g,按料液比1∶20,分别加入20%、40%、60%、80%、100%乙醇10 mL,在60 ℃水浴中提取30 min,超声功率为420 W,超声频率为高频(61 kHz),过滤,定容至50 mL,按照“1.3.1”步骤加样,测定吸光度,计算总黄酮含量.

(5)料液比对总黄酮提取率的影响.

准确称取样品粉末0.5 g,分别按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,加入100%乙醇100 mL,在60 ℃水浴中提取30 min,超声功率为420 W,超声频率为高频(61 kHz),过滤,定容至50 mL,按照“1.3.1”步骤加样,测定吸光度,计算总黄酮含量.

(6)提取时间对总黄酮提取率的影响.

准确称取样品粉末0.5 g,按料液比1∶20,加入100%乙醇10 mL,在60 ℃水浴中分别提取10、30、60、90、120 min,超声功率为420 W,超声频率为高频(61 kHz),过滤,定容至50 mL,按照“1.3.1”步骤加样,测定吸光度,计算总黄酮含量.

1.3.3.2总黄酮提取率的计算方法.其计算公式为:

提取率等于(C×V)/M×100%(1)

式中,C为提取液中总黄酮的含量(mg/mL);V为提取液体积(mL),M为样品粉末质量(g)[10].

1.3.3.3响应面分析.

采用 Design Expert 8.0.6 软件设计响应面试验.根据 Box-Behnken 的中心组合试验设计原理,从单因素试验中选取对提取结果影响比较大的4个因素(料液比、超声功率、提取温度、提取时间)为自变量,总黄酮提取率为响应值,共计29个试验点进行组合试验[11-13].因素与水平见表1.

1.3.4体外抗氧化活性试验.

1.3.4.1对·OH的清除作用.

试管中加入1 mL 0.75 mol/L邻二氮菲、2 mL pH等于7.45 PBS溶液、1 mL蒸馏水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 0.01%H2O2,充分混匀后于37 ℃下恒温水浴1 h.536 nm处测定其吸光度Ap;用1 mL水代替H2O2,测定其吸光度Ab;用1 mL样液代替1 mL水,测定其吸光度As[14].根据公式(2)计算对·OH的清除率.以VC作对照.

·OH清除率等于(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%(2)

1.3.4.2对DPPH·的清除作用.

不同浓度的黄酮样液与DPPH 溶液等体积混合,30min后用无水乙醇作参比,在517 nm 处测定其吸光度A1,测定不同浓度的样液与无水乙醇等体积混合液的吸光度A2;DPPH 溶液与无水乙醇等体积混合液的吸光度A0,取3次平行试验结果根据下列公式计算对DPPH·的清除率[15].以VC作对照.

DPPH·清除率等于[A0-(A1-A2)]/A0×100%(3)

1.3.4.3对O2-·的清除作用.取5mL 0.05 mol/L、pH等于8.2 的Tris-HCL 缓冲液25℃水浴预热20min,分别加入1mL 样液、0.5mL 25 mmol/L 的邻苯三酚,混匀后25℃水浴准确反应4min,立即加入2滴8 mol/L HCl终止反应.299 nm处测定吸光度A1,空白对照组的吸光度A0.将邻苯三酚溶液用0.5 mL 蒸馏水代替,得到吸光度A2.取3 次平行试验结果根据下列公式计算对O2-·的清除率.以VC作对照[16].

O2-·清除率等于[A0-(A1-A2)]/A0×100%(4)

1.3.4.4总还原力的测定.

1.0mL 样液加入2.5mL 的1%铁溶液和2.5mL 的0.22 mol/L 磷酸盐缓冲液,混合均匀后于50℃水浴中反应30min,迅速冷却加入10%三氯乙酸2.5mL,在4 000 r/min下离心10min.最后取2.5mL上清液,加2.5mL 蒸馏水和2.5mL 0.1%三氯化铁溶液,混匀后静置10min 测定700 nm 处的吸光度[17].以VC作对照.

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1提取温度的选择.

由图1可见,随着温度的升高总黄酮的提取率先增加后降低,在60 ℃时,总黄酮提取率达峰值(13.3%).继续升高温度,总黄酮提取率逐渐降低,高温条件下,致使黄酮类化合物的结构被破坏或影响其析出,导致总黄酮提取率降低.按照单因素试验结果选择,应以60 ℃为宜.

2.1.2乙醇浓度的选择.

由图2可知,在乙醇单因素条件下,随着乙醇浓度的增加,总黄酮的提取率先升高后降低.在乙醇濃度为60%的条件下,所提取总黄酮提取率达到最高值(13.58%).随着浓度增加,致使脂溶性杂质增加,抑制了总黄酮的浸出,逐渐降低了其提取率,因此选择60%的乙醇浓度作为提取溶剂.

2.1.3料液比的确定.由图3可知,随着料液比的增多,总黄酮的提取率先增加后降低.在料液比1∶50处,所提取的总黄酮提取率达18.62%.继续增大料液比后,总黄酮提取率不再增加甚至明显降低,且继续增大溶剂量既浪费溶剂又不易回收,所以选择料液比1∶50为宜.

2.1.4超声功率的选择.

由图4可知,随着超声功率的增大,总黄酮的提取率也相应增加.在超声功率达300 W时,所提取的总黄酮提取率为13.86%.继续增大超声功率,总黄酮提取率开始降低.可能由于超声功率的增大导致了总黄酮的结构被破坏,所以超声功率以300 W为宜.

2.1.5提取时间的确定.

由图5可知,在10~30min内总黄酮提取率随着时间的增加而增大,在30 min总黄酮提取率达到最高值(12.78%).随着时间继续增加总黄酮提取率开始降低,可能是因为长时间使黄酮类化合物的结构遭到破坏或粉末溶出其他杂质,使得总黄酮提取率降低.故为了保证总黄酮的提取率以及减小提取周期,以30 min为宜.

2.1.6超声频率的选择.经分析,当超声频率为低频(35 kHz)时,总黄酮的提取率要优于高频(61 kHz),达12.85%.所以在超声辅助提取时选用低频(35 kHz)即可.

2.2响应面试验

2.2.1响应面正交试验.根据表1设定的水平和因素,共设29 个试验点,其中24 个为析因点,5 个为零点.得到各个试验条件的总黄酮提取率,试验结果见表2.

由Orign 2015软件分析得到回归方程为:Y等于19.13+0.033A+0.069B+0.17C+0.11D-0.015AB+0.06AC-0.038AD- 0.04BC+0.028BD-0.04CD-0.16A2-0.13B2-0.24C2-0.19D2,其中Y为总黄酮含量的预测值.该模型的预测复相关系数R2等于0.984 7,矫正系数Adj R2等于0.969 4,说明试验的实际值和预测值拟合度较好.模型P<0.000 1,说明该模型极其显著,在统计学上是有意义的.A、C 2个因素所模拟的一次项小于0.05,说明因变量和所选自变量之间的线性关系显著,该回归方程能代替试验真实点分析试验结果.模拟的二次项B2(P<0.01),表明B因素对总黄酮提取率达到极显著的水平,交互项BC的P 值<0.05,达到显著水平,由此可知,料液比与超声功率、超声功率与提取时间、提取温度与提取时间这些因素之间都存在一定的交互作用,并且它们之间的交互作用会对总黄酮提取率产生显著的影响.

2.2.2响应面交互作用分析.

通过Design-Expert 8.0.6 软件,将AC、BD、CD交互进行分析比较,做出响应面曲线图,见图6.由图6可知,当各因素在一定范围内增大时,对应的响应值也增大;但当响应值达到最高点,各因素的值继续增大时,其响应值却不断减小.等高线图的中心点在3D 图上的投影即最高点,表明该点的提取率最高.

2.2.3优化与验证试验.

依据以上响应面试验模型和结果分析,得出最佳提取条件下总黄酮提取率为19.18%,料液比1∶41.2,超声功率328.8 W,提取温度63.2℃,提取时间37.8min.在此最佳条件下,将平行验证试验重复进行5次,可得总黄酮提取率平均为19.07%.实际所测得的提取率的平均值和预测值减少0.11%,表明该模型的可靠性较高,并且提取工艺的重复性良好,在后续试验中可选取以上条件进行抗氧化活性研究.

2.3总黄酮体外抗氧化活性根据图7能够看出,总黄酮对·OH、O2-·、DPPH·均能够起到清除作用,并且在试验浓度范围内,对自由基的清除能力呈现量效关系.当黄酮浓度为2 mg/mL左右时,对·OH、O2-·和DPPH·的最大清除率分别为11.70%、32.00%和75.86%.在试验浓度范围内,总黄酮和VC的还原力均随浓度的增大而增大(图8),线性关系较好,其中2 mg/mL的黄酮与0.67 mg/mL的VC几乎均等,可见其总黄酮体外抗氧化活性较好.

3结论

该试验采用响应面法优化多穗石柯总黄酮的提取工艺条件,然后在最佳提取条件下对其进行含量测定,并研究其体外抗氧化活性.结果表明,多穗石柯总黄酮提取的最优条件为:超声功率328.8 W、超声频率35 kHz、乙醇浓度60%、料液比1∶41.2、提取温度63.2 ℃、提取时间37.8 min,总黄酮提取率为19.18%;其黄酮对·OH、O2-·、DPPH·均能够起到清除作用,当总黄酮浓度为2 mg/mL时,对它们的最大清除率分别为11.70%、32.00%和75.86%.浓度为2 mg/mL的总黄酮与0.67 mg/mL VC的吸光度几乎均等,可见其总黄酮体外抗氧化活性较好.通过响应面法优化,采用超声波提取提取法多穗石柯中的黄酮类化合物,所用时间短,要求温度低,提取率好,方法简单易行,具有明显的优势.

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抗氧化引用文献:

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