《关于粮油检验中标准曲线问题》
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摘 要：粮食中药残、金属元素、添加剂、真菌毒素检验中涉及大量色谱、光谱分析方法,正确理解把握标准曲线是粮食检验的薄弱环节,根据日常检验实践的积累,对工作中常见问题进行探讨和总结.
关键词：粮油检验;标准曲线;制作;检验;使用
中图分类号：TS210 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2020）06-0065-02
粮食质量安全是粮食安全的重要组成部分,加强粮食质量检验基础工作和提高粮油检验员业务技术能力是行业发展的需要,是贯彻中国好粮油行动的具体体现.多年来,基层粮食检验机构和企业对粮油的感官检验、物理检验和常规化学检验掌握较准确,实践积累多,而在药残、金属元素、添加剂、真菌毒素等需使用色谱、光谱、质谱类仪器上则存在储多问题,“检得慢、检不出、检不准”等问题突出.尤其在标准曲线的制作、检验、运用上存在许多问题和误区,直接导致检验结果出现偏差,甚至严重失真.笔者总结多年来从事粮食检验的经历,就在粮油检验中使用标准曲线经常见到和碰到的问题或者疑惑进行粗浅的讨论.
1粮食检验标准曲线的本质
我们粮油分析检验的首要任务是定性和定量,定性可以说是有和无的问题,定量是提供待测物质含量范围的一个过程,这当中包含了任何定性定量都有不确定度的含义.而普遍采用的标准曲线是粮食日常理化分析和检验中的日常性工作.粮油检验中的标准曲线可定义为：一系列已知含量（浓度）的物质的量值与仪器响应（仪器的峰高或峰面积）之间的关系,即一系列经过确认的浓度梯度在仪器上的信号反映.通过建立数学模型,处理后就得到方程,方程的图形化表示就是我们所说的标准曲线.粮油检验中,得到的标准曲线的作用是什么呢?就是使用标准曲线查出被测物质的含量（浓度）.我们在日常检验中通常是这样做的,首先我们拿出一系列已知含量的物质（或组分）,进样后得到一组与含量对应的仪器信号值,信号值与被测物的含量存在的对应关系,就是一种函数关系.在数学上我们叫做曲线拟合,显而易见,直线最简单,因此,采用直线方程进行拟合是我们最常用的一种方式.当然,个别时候也用到多项式拟合等形式.
2粮食检验标准曲线的制作
2.1粮油检验中常见错误做法
实际检验中,由于理论标准知识欠缺或操作不严谨,常出现以下情况：
（1）减少标准样品点.经常发现一些检验员为实现相关系数R值合格或减小工作量,人为减少标准点;（2）被测量值已超出标准曲线的浓度范围仍使用标准曲线,或者被测量值在曲线的低点（高点）时仍使用;（3）曲线相关系数R值不符合要求,照样使用标准曲线.
2.2制作标准曲线的规则
那么,标准曲线到底应该怎么做呢,是有明确标准规定的.国家标准GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中进行了以下基本原则的规定：
（1）标准曲线都有一定的浓度范围,被测物质一般也有一定的测量范围,一定要保证两个范围相互匹配,如不匹配,则需对标准浓度系列或被测物浓度进行调整;（2）标准品与被测样品在组分构成上要尽量保持一致以减小干扰;（3）標准品的浓度值尽量等距分布在曲线范围内;（4）标准品的每个浓度点要至少重复2次,并且要从前处理（稀释）开始;（5）标准样品至少要有3个浓度梯度.
实际检验中,我们粮食国家方法标准中大部分列有标准浓度系列,尽量按标准规定去做.如果检验任务重或检验项目比较有把握时,想要适当减少标准浓度点,则需要我们有理论的支持,同时最好有实践的确证.无论如何,至少要有3个浓度梯度是最低标准.常规检验工作中我们经常采用线性校准,主要是线性方程更为简单.
3粮食检验标准曲线的检验
粮食标准曲线的检验,是标准曲线应用很重要的一个方面,但同时也是我们粮油实际检验操作中不容易理解和掌握的地方,针对此问题的争论也是最多的.
（1）标准曲线的线性检验：其实是校准曲线的精密度检验.一般对于多个被测物浓度梯度所获得的响应峰高或峰面积值制作的校准曲线,通常要求相关系数|r|≥0.9990,如果达不到此水平,则需要查找原因,并给予纠正,重新制作合格校准曲线.标准曲线的线性（精密度）检验,实际上真正含义就是：我们检验测得的若干个浓度点,在我们拟合成的直线方程上下左右的分布状态.标准曲线的拟合,数学上的原理是曲线上所有点以最小二乘法（OLS）拟合,曲线到所有点的垂直距离的和为最小.通过原理可以看出,标准曲线在实际上不是必须通过全部浓度点,而是从总体上更接近全部浓度点.因此,线性检验实际上就是看这些测试点与拟合直线的距离,确认是否出现了异常状态.
（2）标准曲线的截距检验：这是一种校准曲线准确度的检验.线性检验如果合格,则对标准曲线进行线性回归,从而取得回归方程y等于a+bx,然后进行相应t检验.一般取95%置信水平,如无显著性差异,则a可做0处理,方程简化为y等于bx,即x等于y/b.通过简化处理后,在一定方程线性范围内,我们可以用此方程直接替代校准曲线.这种情况下,样品测量的峰高或者峰面积值经校正空白后,就可以直接计算出试样浓度.如果存在显著性差异,则是表明所得曲线的回归方程准确度不是很高.这时,要找出原因予以校正.
无论何时,我们所得曲线方程不经过以上的检验和相应校正,直接用于我们检验结果的计算,必将给测定结果带来偏差,甚至严重影响结果的可信度.
（3）标准曲线的斜率检验：这其实是对分析方法灵敏度的检验.我们知道,分析方法的灵敏度和实验条件是相关的,会随着实验条件的变化而变化.如果在完全相同的分析实验条件下,只是随机误差导致的斜率变化,一般不会超出一定范围,这个范围只是由于分析方法的精度不同造成的.例如,粮食重金属检验中原子吸收分光光度法国家标准一般要求结果相对差值小于10%等.
4粮食检验标准曲线常见问题的探讨
4.1每次实验是否都要做标准曲线
无论色谱还是光谱类仪器,由于每天所配的流动相都会有所不同,检测器能量也在不断的衰弱过程中,会导致出峰时间、峰面积等相应都有所差异.因此,条件允许情况下,建议每次均做标准曲线.特别是现在仪器均配备多位数自动进样系统,节省时间和人力,检验人员能够承受此工作量.
如果检测项目属于长期连续检测,仪器状态稳定,可以采用标准品进行定位与定量的方式进行曲线确认.比如在样品铅检测分析时,可在实验时选择测定两个标准浓度点（如5?g/L,20?g/L）,若测得两个标准浓度点的响应值与原标准曲线相应点的相对偏差均小于5%时,那么原校准曲线仍可使用.或者采用每批样品测定一个校准曲线中间点浓度的标准液,其测定浓度与校准曲线标准点的浓度相对误差不超过规定范围也可.特別需注意的是,检测项目不同,分析测试方法不同,校准曲线斜率的稳定性是不同的,采用上述方法的前提中校准曲线的斜率较为稳定.
4.2曲线相关系数有效数字保留问题
国家标准GB5750.3-20068.2.7项规定如下：相关系数只舍不入,保留到小数点后出现非9的一位,如0.999987→0.99998.如果小数点后出现许多位9时,最多保留小数点后4位,即0.9999.
4.3粮食检验标准曲线是否必须过原点
标准曲线不一定非要过原点,只要线性好就可以了.因为做空白的话基本上不会过原点.从原点（0,0）代表的意义来考虑,即所测组分浓度为零的时候,信号响应值（峰高或峰面积）是否也为零.理论上色谱分析可以,而光谱分析就讲不通了,浓度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零.
4.4检验中空白测出负值怎么办
空白的意义,是代表我们实验中选择的空白（试剂、器皿等）对仪器响应/信号的影响,有此时候是正方向的,也可能是负方向的,从理论上讲,必须减掉空白.
4.5浓度法还是体积法进样哪个更适合粮食检验标准曲线
一般我们制作标准系列时,是配制不同浓度,进样相同体积,大部分粮食国家方法标准也采用此法,这即是浓度法进样.个别时候,也可能会用到同一浓度不同体积来进样,称为体积法进样,并不太常见.浓度法进样时溶剂的环境（体积）是一致的,可以想像这样在判断溶剂（或溶剂中干扰物质）和被测物质更加容易,更好确认.体积法进样中我们可以想到,干扰物质可能会随标准系列的变化而变化,实现待测物质的确认就会受到干扰.还有一点就是小体积进样时不确定度会较大.因此,与浓度法进样相比,体积法要得到理想的标准曲线可能会更难,做不好,对结果的影响是巨大的.另外还有一个问题,就时进样系统物理体积的限制问题,较大跨度的浓度系列使用体积法进样是不太容易实现的.通过两种进样方式的比较论述可以看出,浓度法进样具有更多优点,比如更容易做出理想的标准曲线,更容易实现较大浓度跨度的进样,更容易实现待测物质的确认等.基于浓度进样法的以上优势,我们粮油检验标准曲线制作还是建议使用浓度进样法.
4.6样品是负值时,结果怎么确定
日常检验中,经常会出现根据标准曲线计算样品检测为负值的情况,我们一般选择这样几种方式确认和报告结果：未检出,低于检出限,低于定量限,低于标准曲线第一点的样品浓度.一般来说,以上几种确认和报告结果的方式都可以采用,实际区别是四种选择下面的风险是不一样的.
报告未检出时,要加入界定语描述,如“本实验室、本仪器、本方法未检出”等.如果不体现这些具体的界定语描述,仅“未检出”的结果报出,歧义就很大很多.
检出限（LOD）是我们进行某种组分检测时定性检出的标志,它一般是和空白统计比较后,计算出来的.通常检出限用基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量,或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差来确定.
定量限（LQD）是可以定量检出的标志,其RSD定为10%,定义为样品中被测物能被定量测定的最低量,现实检验中要求其测定结果应具有一定的准确度.定量限的意义主要是体现了实验分析方法是否具有较好的定量检测能力.
标准曲线第一点的样品浓度值,可以理解为是我们比较可信的仪器测定值.低于第一点的样品浓度值,则其可信度就会有疑问,值得怀疑.
总之,报告“低于检出限,低于定量限,低于标准曲线第一点的样品浓度”,风险依次降低.如果国标方法中明确了检出限或定量限,推荐直接报告小于国家标准规定的限值.
正确理解和使用标准曲线,是当前粮油检验专业技术人员开展检验工作的基础.随着粮食检验由简单的物理检验向成分分析、污染物监测、添加剂的检验、新产品开发等领域的拓展,标准曲线的应用越来越普及.因此,根据日常检验实际,做以探讨交流.
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