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基因克隆和大刺鳅论文范文

《大刺鳅生长激素基因克隆和表达分析》

该文是关于基因克隆和大刺鳅方面毕业论文题目范文与基因克隆有关专科开题报告范文.

摘要：【目的】揭示生長激素（GH）是否能以旁分泌或自分泌方式对大刺鳅（Mastacembelus armatus）的生长和发育起作用,为其生长调节研究积累基础数据.【方法】采用RACE克隆大刺鳅GH基因cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对大刺鳅不同组织及胚胎不同发育时期GH基因的表达情况进行分析.【结果】大刺鳅GH基因cDNA序列全长815 bp,其中,5'端非编码区长33 bp,3'端非编码区长167 bp,开放阅读框（ORF）615 bp,共编码204个氨基酸,GenBank登录号MH885947;大刺鳅GH氨基酸序列的前17个氨基酸残基组成信号肽,也存在4个保守的半胱氨酸残基（69Cys、177Cys、194Cys和202Cys）.大刺鳅GH蛋白分子量为23007.33 Da,理论等电点（pI）为6.90,其氨基酸组成中以亮氨酸（Leu）的含量最高（15.7%）,丝氨酸（Ser）次之（14.2%）,色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）.大刺鳅GH氨基酸序列与斑鳜（Siniperca scherzeri）、花鲈（Lateolabrax maculatus）和黄鳝（Monopterus albus）的同源性较高,对应的同源性分别为95.59%、95.07%和92.16%;在基于GH氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树中,大刺鳅与同属于合鳃目的黄鳝聚为一支,亲缘关系最近.GH基因在大刺鳅不同组织中均有表达,其中以脑组织中的相对表达量最高,而肠道中的相对表达量最低;GH基因在大刺鳅胚胎各发育时期也均有表达,其中以囊胚期的相对表达量最高,而出膜期的相对表达量最低.【结论】大刺鳅GH基因具有高度的保守区域,在各组织中广泛表达,尤其在脑组织中高表达,说明GH是以自分泌或旁分泌方式对大刺鳅生长发挥重要作用,且在胚胎发育过程中对细胞分化具有促进作用.

关键词：大刺鳅;生长激素（GH）;基因克隆;保守区域;系统发育进化树;表达分析

中图分类号： S965.199文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）01-0194-08

Abstract：【Objective】To investigate whether growth hormone（GH） played a paracrine or autocrine role in the growth and development of Mastacembelus armatus, which could provide the essential basic information for growth-rela-ted research of the M.armatus. 【Method】In this experiment, the full-length cDNA sequence encoding GH of the M. armatus was cloned through the RACE techniques. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the GH gene expression in different tissues and at different embryo development stages. 【Result】The full length cDNA of GH gene was 815 bp with 33 bp 5'-untranslated region, 167 bp 3'-untranslated region, and 615 bp open reading frame （ORF）. It enco-ded 204 amino acids（GenBank number：MH885947）. The first 17 amino acid residues of GH amino acid sequence formed signal peptide, and there were also 4 conserved cysteine residues （69Cys,177Cys,194Cys and 202Cys）. The molecular weight of GH protein was 23007.33 Da, and the theoretical isoelectric point （pI） was 6.90. Among the amino acid components, content of leucine （Leu） was the highest （15.7%）, content of serine （Ser） was the second （14.2%）, and content of tryptophan（Trp） was the lowest（0.5%）. The GH amino acid sequence of the M. armatus had high homology with Siniperca scherzeri, Lateolabrax maculatus, and Monopterus albus, with corresponding homology of 95.59%, 95.07% and 92.16%, respectively. On the phylogenetic tree based on GH amino acid sequence homology, M. armatus and the M. albuswere clustered into one branch, their genetic relation was the closest. The results of RT-qPCR showed GH mRNA was expressed in different tissues andat all embryonic stagesof the M. armatus,that the expression of GH mRNA was the highest in the brain tissue and the lowest in intestine. During the embryonic development period, the expression of GH mRNA was the highest at blastocyst stage and the lowest at membrane production stage. 【Conclusion】The GH gene of M. armatusalso has a highly conserved region and is widely expressed in various tissues, especially in brain tissues. It is suggested that GH in the form of autocrine or paracrine, plays an important role in the growth of M. armatus,and promote cell differentiation during embryonic development.

Key words： Mastacembelus armatus;growth hormone （GH）;gene cloning; conserved region; phylogenetic tree; expression analysis

Foundation item： China-ASEAN Maritime Cooperation Foundation（Waicaihan〔2017〕513）;Guangdong Marine Fishery Science and Technology Research and Development Projec（A201601A05）;Guangdong Marine and Fishery Development Special Project（2017A0007）

0 引言

【研究意义】大刺鳅（Mastacembelus armatus）俗称纳锥、石锥、粗麻割、辣椒鱼和刀鱼,隶属于合鳃目（Symbranchiformes）、刺鳅科（Mastacembelidae）、刺鳅属（Mastacembelus）（Nelson,2006）,广泛分布于东南亚等国家,主要栖息在热带亚热带的不同水系中（Cakmak and Alp,2010;周惠强等,2019）.在我国,大刺鳅主要分布于福建、广东、广西、贵州、云南和海南等南方地区.大刺鳅富含多种氨基酸,营养丰富,具有很高的经济价值和研究价值.目前,大刺鳅人工养殖产业尚处于起步阶段,其苗种来源主要依靠野生捕捞,导致我国大刺鳅野生资源急剧减少,在福建、广东和湖南等省已被列为重点保护野生水生动物（周惠强等,2019）.因此,加强大刺鳅生长发育及人工养殖技术研究,对有效保护和利用大刺鳅种质资源具有重要意义.【前人研究进展】目前,针对大刺鳅的研究主要集中在养殖繁育技术（陈方平等,2015;张建铭等,2015;薛凌展,2016）、生理生化（Verma and Alim,2015;初庆柱等,2016;Han et al.,2018）、群体遗传（杨华强等,2016;林婷婷,2017,江小璐,2018）及形态差异（舒琥等,2017,周惠强等,2019）等方面,而有关大刺鳅生长相关基因的研究鲜见报道.生长激素（Growth hormone,GH）是由下丘脑—垂体前叶嗜酸性细胞合成分泌的一种约含200个氨基酸的单链多肽激素,与脊椎动物的生长发育密切相关（Yowe and Epping,1995）.GH分泌受下丘脑分泌生长激素释放激素、促性腺激素释放激素和生长激素抑制激素的调控.GH不仅能增强鱼类的食欲,促进饵料转化率及提高其生长速率（Moller et al.,2007）,还在鱼类生长调控方面发挥重要作用,与渗透压平衡（Sakamoto et al.,1997）、生殖繁育（Hull and Harvey,2002;周立斌等,2004）、游泳行为（Johansson et al.,2004）、能量代谢（Rousseau and Dufour,2007）及免疫（Yada,2007）等生理活动的调节也密切相关.在鱼类养殖业方面,GH被认为是一种潜在、最有效的生长促进剂之一,其促生长作用主要有两种方式：一种是直接激活靶细胞膜上的生长激素受体（GHR）而实现其生物学效应;另一种是促进肝脏和其他组织产生胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors,IGFs）,通过GH-IGF轴而间接发挥作用（徐敏华等,2012）.至今,已克隆获得斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）（张为民等,2003）、淇河鲫（Carassius auratus gibelio var）（高春生等,2008）、鳜（Siniperca chuatsi）（刘臻等,2010）、军曹鱼（Rachycentron canadum）（郝羽等,2011）、达氏鲟（Acipenser dabryanus）（单喜双等,2015）及兰州鲇（Silurus lanzhouensis）（王发新等,2015）等鱼类的GH基因,并在原核表达载体中成功表达.【本研究切入点】GH对鱼类的生长及繁育均具有重要作用,但至今有关大刺鳅GH的研究尚无报道.【拟解决的关键问题】采用RT-PCR和RACE克隆大刺鳅GH全长cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对大刺鳅不同组织及胚胎不同发育时期GH基因的表达情况进行分析,旨在揭示GH是否能以旁分泌或自分泌方式对大刺鳅的生长和发育发挥作用,为其生长调节研究积累基础数据.

1 材料与方法

1. 1 试验材料

大刺鳅成鱼采自云南澜沧江,平均体质量80±5 g/尾,无伤病,体格健壮.总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit （DP431）购自天根生化科技（北京）有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞（B528413-0010）购自生工生物工程（上海）有限公司;Taq DNA聚合酶（R500A）、pMD19-T载体（6013）及AR-Ter? RACE 5'/3' Kit（634860）试剂盒购自TaKaRa公司;RNA Keeper Tissue Stabilizer （R501-01）保存液、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Q311-02）试剂盒及HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA Wiper）（R223-01）试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司.所有引物合成及测序均由生工生物工程（上海）有限公司完成.

1. 2 总RNA提取和cDNA第一链合成

采用MS-222（50 mg/L）麻醉后,无菌采集大刺鳅成鱼的脑、肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胃、肠道、眼、鳃和性腺等11种组织,迅速放入RNA Keeper Tissue Stabilizer（R501-01）保存液中,用RNAprep Pure Tissue Kit（DP431）提取其总RNA.选择不同发育时期的大刺鳅胚胎（多细胞期、囊胚期、原肠胚期、肌节出现期和出膜期）样品置于液氮中保存,提取總RNA用于后续研究.采用1.2%琼脂糖凝胶电泳和GoldView染色检测总RNA完整性,并以分光光度计检测其浓度及纯度;然后运用ARTer? RACE 5'/3' Kit（634860）中的反转录试剂盒合成cDNA第一链.

1. 3 GH基因cDNA序列克隆及测序分析

依据GenBank已公布的黄鳝、斜带石斑鱼等物种GH基因序列设计引物P1和P2（表1）,用于扩增大刺鳅GH基因的部分片段;cDNA 5'端和3'端非编码区的扩增采用ARTer? RACE 5'/3' Kit（634860）试剂盒,按照说明进行操作,扩增特异性引物分别为GH-GSP1和GH-GSP2（表1）.PCR产物经纯化后克隆至pMD19-T载体上,再转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序.应用BLAST对获得的大刺鳅GH基因cDNA序列进行同源性比对分析,并推导其开放阅读框（ORF）和编码氨基酸序列;以Clus-talX 2.1进行氨基酸序列比对分析,选择比对模型Multiple Alignment Mode（多序列比对）,默认参数设置,比对方法选用Do Complete Alignment（进行完全比对）;得出的比对分析结果运用BOXSHADE Server（https：//embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html）进行着色处理;采用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行物种同源性分析;利用MEGA 7.0计算进化距离矩阵,以邻接法（Neighbor-joining,NJ）构建系统发育进化树,Bootstrap设为1000.

1. 4 大刺鳅GH基因组织特异性表达检测

以实时荧光定量PCR测定GH基因在大刺鳅成鱼各组织及胚胎发育各时期的表达量.以β-actin为内参基因,依据克隆获得的大刺鳅GH基因cDNA全长设计特异性引物GH-Real-F和GH-Real-R（表 1）;按HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA Wiper）试剂盒说明反转录合成cDNA.实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL：SYBR 10.0 μL,cDNA模板2.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,DEPC水7.2 μL.在Bio-Rad CFX96TM Real Time System仪上进行扩增,扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,进行40个循环.退火温度从60 ℃上升到95 ℃,绘制熔解曲线以判断扩增产物的正确性.使用2–ΔΔCt法换算GH基因在不同组织中的相对表达量,再以SPSS 17.0进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2. 1 大刺鳅GH基因cDNA序列全长及氨基酸序列分析结果

大刺鳅GH基因cDNA序列全长815 bp.其中,5'非编码区长33 bp,3'非编码区长167 bp,开放阅读框615 bp,包含AATAA典型转录终止子加A信号,共编码204个氨基酸（图1）,GenBank登录号MH885947.SignalP-5.0 Server预测分析结果显示,大刺鳅GH氨基酸序列的前17个氨基酸残基组成信号肽,切割位点位于17Ser和18Gln间;ExPASy-ProtParam Tool预测结果显示大刺鳅GH蛋白分子量为23007.33 Da,理论等电点（pI）为6.90,其氨基酸组成中以亮氨酸（Leu）的含量最高（15.7%）,丝氨酸（Ser）次之（14.2%）,色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）.大刺鳅GH蛋白不稳定系数为56.38,是一种不稳定蛋白.蛋白氨基酸残基亲/疏水性总平均数（GRY）为-0.144,说明该蛋白为亲水性蛋白.

2. 2 大刺鳅GH氨基酸序列同源性比对及系统发育进化树

大刺鳅GH氨基酸序列与GenBank上其他19种物种的GH氨基酸序列进行比对分析,结果发现在所有物种中均存在4个保守的半胱氨酸（Cys）残基,且近C-端区域内的序列高度保守（图2）.利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW（https：//www. genome.jp/tools-bin/clustalw）对比GenBank已公布物种（表2）的GH氨基酸序列,发现大刺鳅GH氨基酸序列与斑鳜（Siniperca scherzeri）、花鲈（Lateolabrax maculatus）和黄鳝（M. albus）的同源性较高,对应的同源性分别为95.59%、95.07%和92.16%;在基于GH氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树（图3）中,大刺鳅与同属于合鳃目的黄鳝聚为一支,亲缘关系最近,而与陆生动物的同源性仅为25.49%～33.33%,即鱼类与哺乳动物形成独立的进化分支,与形态学系统发育进化树相吻合.

2. 3 大刺鳅GH基因的组织和时空特异性表达情况

采用实时荧光定量PCR检测GH基因在大刺鳅不同组织中的表达情况,结果（图4）显示,大刺鳅GH基因在脑组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量（P<0.05,下同）;其次是肝脏、肌肉、性腺和心脏;肠道中的相对表达量最低.在大刺鳅胚胎发育的各阶段均有GH基因表达,其中以囊胚期的相对表达量较高,其次为原肠胚期,肌节出现期和出膜期的相对表达量较低（图5）.

3 讨论

大刺鳅是一种特种经济鱼类,具有较高的经济价值和研究价值.本研究利用RACE克隆获得的大刺鳅GH基因cDNA序列全长815 bp,其ORF为615 bp,编码204个氨基酸;大刺鳅GH蛋白氨基酸也存在4个保守的半胱氨酸残基（69Cys、177Cys、194Cys和202Cys）,与其他已知动物的GH氨基酸序列高度保守.大刺鳅与其他27种物种的GH氨基酸同源性分析结果表明,大刺鳅与同属于合鰓目的黄鳝亲缘关系最近,在系统发育进化树上聚为一支.通过构建的系统发育进化树还可看出,大多数鱼类的系统进化分类结果与传统形态学分类一致,说明基于GH氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树能较真实地反映物种进化关系.

GH不仅在生长轴中居于中心位置,还在鱼类的个体生长过程中发挥关键性作用.在垂体水平上,GH可通过超短反馈环路进行自分泌和旁分泌的调控（李文笙和林浩然,2010）,因此明确GH基因在鱼类组织中的表达情况,对研究鱼类生长具有重要意义.本研究结果表明,GH基因在大刺鳅不同组织中均有表达,其中又以在脑组织中的相对表达量最高,与在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（Yang et al.,1999）、斜带石斑鱼（Li et al.,2005）和瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）（徐敏华等,2012）中的表达模式相似;在脾脏、肝脏和性腺等组织中也有表达,与在蓝太阳鱼（Lepomis cyanellus）（曹运长等,2005）、鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）（Dong et al.,2010）和瓦氏黄颡鱼（徐敏华等,2012）等鱼类中的研究结果一致.此外,大刺鳅成鱼和其他硬骨鱼一样,GH基因在肌肉组织中的相对表达水平较高,表明GH除了参与代谢调节外,还与肌肉发育和生长有关.GH可直接与肌肉等靶器官上的GHR结合,进而影响细胞营养物质分泌及其代谢（Dunshea et al.,1992）.本研究在大刺鳅的性腺和脾脏中也检测到GH基因呈微量表达,与垂体外分泌的GH可参与虹鳟生殖（Loir,1999）及罗非鱼（Oreochromis mossambicus）免疫（Yada et al.,2002）等生理活动的结论一致.可见,大刺鳅GH基因在垂体外组织中也存在广泛表达的现象,由此推测大刺鳅与其他鱼类一样,在垂体外组织中合成的GH可能是以自分泌或旁分泌方式直接作用于自身或相邻细胞而发挥重要的生理功能.如在肌肉细胞中合成分泌的GH,可通过IGF介导或其他途径对其代谢进行调节;在性腺中合成分泌的GH则通过直接作用于性腺,以调控生殖活动及其功能（徐敏华等,2012）.

本研究结果表明,GH基因在大刺鰍胚胎各发育时期均有表达,其中以在囊胚期的相对表达量最高,出膜期的相对表达量最低.目前,有关GH基因在鱼类胚胎发育时期表达的研究较少.曹宏（2008）研究发现,GH基因在中华鲟（Acipenser sinensis）胚胎发育的14个特定时期一直处于高效表达状态;Ahmed等（2011）在进行斑马鱼（Dranio rerio）的GHR信号相关因子表达分析时发现,GH基因在2-细胞时期呈高表达,其他时期的表达量较低;但臧坤（2014）在星突江蝶（Platichthys stellatus）胚胎发育各时期均未检测到GH基因的表达.说明GH基因在不同硬骨鱼类胚胎发育时期的表达存在种类差异,但有关GH在胚胎发育过程中的作用还有待于进一步探究.

4 结论

大刺鳅GH基因具有高度的保守区域,在各组织中广泛表达,尤其在脑组织中高表达,说明GH是以自分泌或旁分泌方式对大刺鳅生长发挥重要作用,且在胚胎发育过程中对细胞分化具有促进作用.

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（責任编辑兰宗宝）

上文结束语:上文是一篇适合不知如何写基因克隆方面的基因克隆和大刺鳅专业大学硕士和本科毕业论文以及关于基因克隆和大刺鳅论文开题报告范文和相关职称论文写作参考文献资料.

基因克隆和大刺鳅引用文献: