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《参苓白术散对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞、Kupffer细胞5LOLTB4通路的影响》

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〔摘要〕目的基于5-脂氧化酶（5-lipoxygenase,5-LO）/白三稀B4（leukotrienes B4,LTB4）通路探讨参苓白术散对非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）大鼠肝细胞、库普弗（Kupffer）细胞作用机制.方法通过Ⅳ型胶原酶离体循环灌注法分离SD大鼠肝细胞及Kupffer细胞,利用油红O染色观察肝组织脂滴蓄积情况;ELISA法检测肝组织LTB4含量;RT-PCR法、Western blot法检测大鼠肝细胞及Kupffer细胞5-LO、白三烯B4受体（LTB4 receptor type 1,BLT1）mRNA及蛋白表达水平.结果高脂饮食8周能诱导大鼠NAFLD表现,建模成功.与模型组比较,2个药物剂量干预组大鼠肝组织LTB4含量均显著下降（P<0.01）;肝细胞、Kupffer细胞中的 5-LO、BLT1 mRNA及其蛋白表达水平均亦有不同程度的下调（P<0.01）.2个剂量组间比较,以高剂量参苓白术散组效果较为显著（P<0.05或P<0.01）.结论参苓白术散可能通过抑制NAFLD大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO/LTB4通路的激活,减轻肝脏脂质蓄积,发挥防治NAFLD的作用.

〔关键词〕参苓白术散;肝细胞;Kupffer细胞;5-脂氧化酶;白三稀B4

〔中图分类号〕R285.5〔文献标志码〕A〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.009

〔Abstract〕 Objective To investigate the action mechani of Shenqi Baizhu Powder （SBP） on hepatocytes and Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats based on 5-lipoxygenase （5-LO） / leukotrienes B4 （LTB4） pathways. Methods SD rat hepatocytes and Kupffer cells were isolated by in vitro perfusion of type IV collagenase. The hepatic lipid accumulation of liver tissue was detected by oil red O staining. The content of LTB4 in liver tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent ELISA. The mRNA and proteins expression of 5-LO and LTB4 receptor type 1 （BLT1） in were detected by RT-PCR and Western blot. Results It was observed that the rats of NAFLD model were induced by high-fat-diet with 8 weeks succesully. Compared with the model group, the content of LTB4 were decreased significantly in in the two drug intervention groups （P<0.01）, as well as the lower expression levels of gene and proteins expression of 5-LO and BLT1 in hepatocytes and Kupffer cells for the varying degrees （P<0.01）. Compared between two dose groups, the high-dose SBP group showed more significant effects （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion SBP may play a role in preventing and treating NAFLD by inhibiting the activation of 5-LO/LTB4 pathway in liver cells and Kupffer cells of NAFLD rats, and reducing liver lipid accumulation.

〔Keywords〕 Shenling Baizhu Powder; hepatocyte; Kupffer cells; 5-LO; LTB4

近年來,随着生活水平的提高,饮食结构的变化,非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率呈上升趋势,发病年龄也日趋年轻化,已成为我国第一大慢性肝病以及健康普查发现肝脏转氨酶异常的首要病因[1-4].NAFLD发病机制复杂,现代医学缺乏有效的药物治疗.我们前期研究发现参苓白术散具有显著的降低血脂,缓解肝脏炎症,防治NAFLD肝疗效确切,可能在NFALD终末防治效应方面发挥多环节、多路径、多靶点的整合治疗作用[5].白三稀B4（leukotrienes B4,LTB4）作为一种经典的促炎脂质,必须在5-脂氧化酶（5-lipoxygenase,5-LO）催化后,经两个G藕联蛋白受体-白三烯B4受体（LTB4 receptor type 1, BLT1）和BLT2表达高广谱和高应答的致炎效应[6].研究表明,5-LO、LTB4和BLT-1在代谢综合征如肥胖、胰岛素抵抗等相关疾病导了慢性系统性低度炎症的触发和放大过程[7].本研究是在前期研究基础上的进一步探索,通过高脂饲料诱导建立NAFLD大鼠模型,旨在从肝细胞、Kupffer细胞水平,探讨参苓白术散对NAFLD大鼠5-LO、LTB4、BLT1的影响,以阐释其部分干预作用机制.

1 材料

1.1 药物

参苓白术散（人参15 g,白术15 g,茯苓15 g,薏苡仁9 g,砂仁6 g,山药15 g,桔梗6 g,白扁12 g,莲子9 g,炙甘草9 g）为中药配方颗粒剂,方药组成及饮片剂量均参照《方剂学》教材[8],由深圳三九医药股份有限公司生产,购自广州暨南大学附属第一医院药房.按免煎中药包装说明（如：人参1袋相当于人参饮片3 g）,换算成1剂参苓白术散饮片的实际剂量,溶于水,调匀制成混悬液备用.

1.2 动物

取8周龄健康成年雄性SD大鼠（SPF级）80只,体质量（200±20） g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,动物合格证号37009200012268,动物许可证号SCXK（鲁）20140007,饲养于暨南大学动物实验中心,饲养环境合格证号：SYXK（粤）2017-0174.随机分为4组,每组20只.

1.3 主要试剂与抗体

大鼠LTB4酶联接免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（GD-DS1584）来自上海古朵生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）来自美国Abbkine公司;实时荧光定量PCR试剂盒（RR047A）来自日本Takara公司;兔抗大鼠Anti-Lysozyme（MA5-32154）、Ⅳ型胶原酶（17104-019）均来自ThermoFisher公司;Anti-5-LO抗体（50-244）、Anti-BLT-1抗体（70-465）均来自美国Prosci公司.

1.4 主要仪器

Epoch型酶联免疫检测仪（美国BioTeK公司）;ELITE ESP型流式细胞检测仪（美国BECKMAN-COULTER公司）;CFX 96 Touch Deep Well Real-Time PCR仪（美国Bio-rad公司）;Trans-Blot Turbo型转膜仪（美国Bio-rad公司）.

2 方法

2.1 动物分组及造模

按随机数字表法将大鼠分成4组,每组20只.分别为：正常组、模型组、参苓白术散低剂量组（10 g/kg）及高剂量组（30 g/kg）.参照我们前期研究[9]采用高脂饲料（基础饲料88%,食用猪油10%,3号胆盐0.5%,胆固醇1.5%）喂养8周建立NAFLD模型.除正常组大鼠以基础饲料喂养,其他各组均以高脂饲料喂养.按10 mL/（kg·d）标准,各组大鼠灌服相应剂量的中药制剂或实验动物饮用水,给药剂量按人和动物体表面积折算[10].每日1次,分笼饲养于18～22 ℃明暗各12 h的SPF级动物实验室内,连续8周.我们在前期研究[9]中確立了低剂量药物组为人临床等效剂量,高剂量药物组为3倍人临床等效剂量.

2.2 标本采集

2.2.1 肝组织、血清标本采集于实验第8周（均禁食不禁水于末次给药12 h后）各组随机选取10只大鼠麻醉后,经腹主动脉采血后处死,取相同部位肝脏若干保存备用.

2.2.2 肝细胞、Kupffer细胞的分离和鉴定我们前期研究已熟练掌握离体循环灌注Ⅳ型胶原酶法提取分离大鼠原代肝细胞、Kupffer细胞,提取的肝细胞、Kupffer细胞纯度均在达到90%以上,完全满足相关实验要求[5,9].

2.3 指标检测

2.3.1 油红O染色后显微镜观察肝组织形态肝组织经冰冻切片,厚约6～8 μm,行油红O染色,甘油封片,光镜下观察肝组织内脂滴分布及病理组织学变化.

2.3.2 ELISA法检测肝组织LTB4 按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠肝组织匀浆LTB4含量.

2.3.3 RT-PCR法检测肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1 mRNA相对表达量取培养的贴壁细胞,经4 ℃,10 000 r/min,离心10 min.弃去上清液,加入1 mL TRizol裂解Kupffer细胞,提取总RNA,用微量核酸分光光度计检测总RNA浓度,按照试剂盒说明,逆转录为cDNA.引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计及合成,选用GAPDH为内参基因.5-LO：正向引物：5'-GTAACTTGAGACGCCAGTGTAG-3',反向引物：5'-AAGCTATACGCTGTCTGGTGGA-3',片段长度：126 bp;BLT1：正向引物：5'-CTTGGCTGCAAACACTGCGGTCTGG-3',反向引物：5'-CTGCAGAATGCTTGACACTACAG-3',片段长度：96 bp;GAPDH：正向引物5'-TGCACCGATCCGGATCATTG-3',反向引物：5' GATGCAGTATGCCATTCGC-3',片段长度：128 bp.依照说明书在冰台上配制20 μL反应液,反应条件为90 ℃持续2 min预变性;95 ℃持续15 s变性;5-LO、BLT1、GAPDH 60 ℃退火20 s;60 ℃延伸1 min,扩增40个循环;再于95 ℃,持续15 s,分析溶解曲线.用Opticon Monitor 3.1软件整理和分析.设定正常组基因表达水平为1.以2-△△Ct为实验项目的基因表达相对于正常组的变化倍数,计算各组大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1 mRNA的相对表达量.

2.3.4 Western blot法印迹法检测大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1蛋白表达每RIPA裂解液（含PM）1 mL加入5×106个细胞,待充分裂解后,14 000 r/min,4 ℃下离心5 min;为避免蛋白降解,在冰台上操作收集上清液.BCA法测定蛋白浓度,对样品上样量的终浓度调整为40～80 μg.采用SDS-PAGE法电泳分离蛋白,湿转膜法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜后,加入含5%脱脂奶粉封闭液,常温下平摇1h,PBS冲洗液洗膜后,加入提前配制好的一抗稀释液（5-LO 1∶1 000稀释;BLT1 11∶1 000稀释）,4 ℃过夜孵育后,再次洗膜除去过量的一抗稀释液,加二抗稀释液（1∶5 000）室温孵育1 h,洗膜后,进行化学发光反应.用Quantity One软件分析目的蛋白与内参的灰度值,并将其比值作为蛋白的表达值进行统计分析.

2.4 统计分析

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用“x±s”表示,多组数据间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,检验水准P<0.05表示差异具有统计学意义.

3 结果

3.1 肝细胞、Kupffer细胞的纯度鉴定

CK-18抗体检测肝细胞纯度为94.57%,Lysozyme抗体检测Kupffer细胞纯度为92.31%.见图1.

3.2 肝组织病理学观察

模型组肝细胞肿胀,核质深蓝染色、靠边,胞浆可见大片的红色脂滴,小叶结构破坏,肝索紊乱;正常组肝细胞排列整齐,胞核淡蓝居中,结构正常,胞浆偶见正常散在的红染脂滴;各药物干预组肝组织染色脂滴红染面积及程度较模型组明显缩小和减轻,参苓白术散高剂量组肝脏组织形态最接近于正常组.见图2.

3.3 各组大鼠肝组织LTB4含量比较

模型组大鼠肝组织LTB4含量较正常组显著升高（P<0.01）;各药物干预组LTB4含量与模型组比较,显著降低（P<0.01）,其中参苓白术散组高剂量与低剂量组间比较差异有统计学意义（P<0.01）.见表1.

3.4 各组大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1

mRNA相对表达量

与模型组比较,各药物干预组大鼠肝细胞、Kupffer细胞中的5-LO、BLT1 mRNA 相对表达量显著下降（P<0.01）.参苓白术散高剂量组与低剂量组比较,大鼠肝细胞、Kupffer细胞中的5-LO、BLT1 mRNA相对表达量下降（P<0.05,P<0.01）.见表2-3.

3.5 各组大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1蛋白表达

与模型组比较,各药物干预组大鼠肝细胞、Kupffer细胞中的5-LO、BLT1蛋白表达水平显著下降（P<0.01）.参苓白术散高剂量组与低剂量组比较,大鼠肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1蛋白表达水平下降（P<0.05,P<0.01）.见表4-5,图3-4.

4 讨论

NAFLD是指除外酒精和其他明确的肝损伤致病因素,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪性样变为主要特征的一组临床病理综合征,包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及由其引起的肝纤维化、肝硬化.目前,研究者认为其发生发展可能与脂质代谢障碍、胰岛素抵抗,摄入过量果糖,脂肪组织功能紊乱,肠道菌群失调导致炎症、氧化应激、内质网应激有关[11].但其确切的发病机制尚未明确.时至今日,现代医学尚无治疗NAFLD的特效药物,对其治疗多以病因治疗为主,如改变生活方式、控制体重及治疗原发病如高血脂症、2型糖尿病,常常选用胰岛素增敏剂如二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮及他汀类调脂药物如阿托伐他汀、普伐他汀等,因有一定的肝毒性,无法长期口服及维持治疗.祖国医学没有脂肪肝这一病名,脂肪肝大致属于“胁痛”“肝著”“肝癖”等病范畴.关于病因病机、治则治法的论述,现代医家认为肝体用失调、脾肾亏虚为其主要特点,痰、湿、浊、瘀、热是其主要病理因素,疾病初期主要治以疏肝理气、健脾和胃;中后期以健脾益肾、化瘀散结为主[12].可见健脾法,贯穿了治疗NAFLD的始终.参苓白术散出自北宋《太平惠民和剂局方》,具有健脾益气、渗湿止泄的功效.Meta分析表明[13],参苓白术散治疗NAFLD存在其优势.笔者前期研究也证实参苓白术散具有顯著的降低血脂,缓解肝脏炎症,防治脂肪肝疗效确切[9].本次实验是对参苓白术散防治NAFLD作用机制的进一步探索.

肝脏的脂肪蓄积主要发生在肝细胞,而位于肝血窦内的肝脏Kupffer细胞是人体内最大的固定巨噬细胞群,约占肝脏所有细胞总数的15%,具有吞噬微生物、清除内毒素,摄取抗原并激发获得性免疫、释放炎性因子,促发肝脏炎症反应的作用[14-15].白三烯（leukotrienes,LTs）是目前已知在炎症损伤中活性最强的趋化因子,在介导炎性细胞的黏附、浸润以及促炎因子的释放过程中发挥着重要的作用[16].5-LO是催化花生四烯酸转化成LTs的关键酶介[17].

LTB4作为5-LO合成的主要产物,主要在肝组织中充分表达.研究发现,在高脂饮食的小鼠肝脏和肌肉组织中LTB4表达显著增加,其增加可促进炎症因子,介导炎症反应,是组织炎症浸润的一个关键[18-19].当机体出现脂质代谢紊乱后,5-LO常在炎症激活的巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞中大量表达,在单核细胞转化为组织细胞的过程中,5-LO表达上调,但在非炎性阶段,其含量无明显变化.研究表明,抑制5-LO的表达能促使Kupffer细胞程序性凋亡,从而减轻小鼠肝损伤[20].因此通过减少5-LO的表达,对抑制肝脏疾病的发病及进展,可能起到治疗作用[21].在高脂饲料诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中,肝组织LTB4分泌增加,其催化酶5-LOmRNA及蛋白表达水平显著上调,其受体BLT1亦上调,表明肝脏脂肪变程度及炎症损伤的进展程度与肝内5-LO、BLT1的表达呈正相关[22-23].可见,肝内5-LO、LTB4、BLT1的表达水平,与肝脂肪变的严重程度呈正相关.本次实验拟通过肝细胞、Kupffer细胞视角,探讨参苓白术散对NAFLD大鼠5-LO/LTB4通路的影响.

本实验病理学结果表明,高脂饲料喂养8周建立大鼠NAFLD模型存在显著的脂质代谢紊乱,参苓白术散可不同程度地降低NAFLD大鼠肝组织LTB4含量,下调肝细胞、Kupffer细胞5-LO、BLT1 mRNA及蛋白表达水平,以高剂量参苓白术散组作用最为显著.参苓白术散在改善肝脏脂肪沉积,可能与剂量有一定的相关性;初步揭示参苓白术散可能是通过抑制NAFLD大鼠5-LO/LTB4通路激活,发挥抗NAFLD的药理作用.当然,参苓白术散对NAFLD的防治也可能是多方面、多层次、多环节、不同药理作用的结果,因此有必要对参苓白术散防治NAFLD的具体机制进行进一步的研究和探讨.

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