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主题:生物化学与分子生物学 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-02-16

生物化学与分子生物学论文范文

生物化学与分子生物学论文

目录

  1. 第一篇生物化学与分子生物学论文范文参考:基于荧光信号放大技术的蛋白质和核酸检测方法研究
  2. 第二篇生物化学与分子生物学论文样文:功能型超分子体系的合成与自组装
  3. 第三篇生物化学与分子生物学论文范文模板:基于化学生物学的中药有效成分牛蒡子苷元等的作用靶点及体内分布研究
  4. 第四篇生物化学与分子生物学论文范例:数据挖掘方法用于参与代谢的小分子生物学功能预测研究
  5. 第五篇生物化学与分子生物学论文范文格式:短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的生物化学、药理学和分子生物学的研究

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第一篇生物化学与分子生物学论文范文参考:基于荧光信号放大技术的蛋白质和核酸检测方法研究

近年来,人们一直致力于发展和完善生物大分子的研究和分析方法,使其更加灵敏、精确、便捷、经济,以满足各个领域对其越来越高的要求.生物分子信号放大检测技术是近年来发展起来的一种利用各种工具酶和纳米颗粒等手段,并结合电化学、光学等技术建立起来的高灵敏检测方法,可实现对生物分子的直接高灵敏检测,是生物分析科学领域中的一个研究重点和热点.如何利用现有分子生物学技术和手段将生物分子的含量、相互作用等信息实时、灵敏、特异地转化为易于检测的物理量并拓展其在分子生物学及生物医学中的应用,如何设计新的信号转换手段和建立新的生物分子信号放大检测技术平台来解决生命研究过程中的新问题,仍然是生物医学和分析化学工作者所面临的重大研究科题.

本工作以上述科学问题为目标,以蛋白质和核酸这两类组成生命的最主要生物大分子为研究对象,利用多种核酸工具酶、纳米颗粒和荧光核酸探针技术,建立了一系列的生物大分子荧光信号放大检测技术平台,在蛋白质和核酸定量分析方面得到了重要的应用.主要内容归纳如下:

1、单球体积荧光放大法检测生物大分子

近年来,随着纳米材料科学的发展,不同组成、大小、形状的磁性纳米颗粒已经广泛应用于生物分析研究领域.功能化的磁性纳米颗粒作为标记探针,已经越来越引起人们的关注.磁性纳米颗粒具有磁性、粒径小、表面积大且表面可修饰等特点.功能化的纳米磁性纳米颗粒标记生物分子时,一方面能够作为载体起到富集、固定的作用,同时还保持了标记生物分子的生物化学活性.另一方面,纳米磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下,能够快速有效地实现免疫复合物与未结合物的分离.所以,在免疫测定中,应用纳米磁性纳米颗粒和磁分离技术能够降低假阳性信号,提高信噪比,从而提高蛋白质检测方法的灵敏度.在本文中,我们基于信号双重扩增(DNA扩增、SYBR Green I/BT-DNA结合物荧光信号扩增)结合磁分离技术,利用落射荧光显微术建立了一种超灵敏的靶蛋白荧光免疫测定方法.在高浓度时,荧光强度与靶抗原在5.0×,10-13~8.0×,10-15mol L-1的浓度对数范围内呈良好的线性关系.在低浓度时,一个功能化得磁纳米球对应一个蛋白分子,这时我们通过计数单个磁纳米球定量检测单个生物分子.磁纳米球的数目和抗体的浓度在8.0×,10-14~3.0×,10-15mol L-1的范围内呈良好的线性关系.

2、多重标记结合RCA技术构建免疫分析新方法用于蛋白质定量检测

为了提高蛋白检测的灵敏度,人们已经努力发展了一些新的蛋白检测技术.其中,荧光检测技术联合信号扩增技术是最流行的检测技术.特定核酸序列的扩增是分子生物学的一项基本技术,随着分子生物学的发展与生物化学、生物物理学等交叉学科在该领域的广泛应用,新的核酸扩增技术不断涌现.其中,滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)技术凭借其高特异性、高灵敏度和易操作性在近几年中逐渐引起人们的注意,并越来越多的用于基础研究和临床诊断分析及医药领域中.与其他核酸扩增技术相比,RCA技术具有高灵敏度、高特异性、多元性和高通量、等温反应和操作简单等优势.为了满足低浓度蛋白检测的需要和解决多重荧光标记和纳米探针的信号放大存在的问题,本章提出了一种基于链霉亲和素-生物素多重结合和滚环扩增辅助组装的级联荧光DNA纳米标签作为信号标记的新型级联荧光信号放大技术超灵敏检测靶蛋白目标分子.荧光强度与人IgG浓度的对数成线性关系,并且动态范围从1×,10-12molL-1-1×,10-15mol L-1.超过3个数量级.线性相关系数为0.995.检测限达到0.9×,10-15mol L-1(采用3倍的信噪比).实验结果出示了该方法具有较宽的动态范围,超高的灵敏度、可接受的重现性、好的特异性和较低的基质效应影响.另外更重要的是,该方法不需要复杂的接合化学并且该方法出示了快的反应动力学和简单的操作在组装荧光DNA标签.与功能化纳米粒子的标签相比,该策略标记物避免了复杂和繁琐的合成工艺.因此该策略将在免疫靶蛋白的超灵敏检测中会成为一个强有力的检测工具.

3、磁性纳米颗粒结合RCA技术构建免疫分析新方法用于蛋白质定量检测

在荧光免疫测定法中,为了定量检测样品中低浓度的靶蛋白,实现超灵敏分析,一个关键因素在于获取强的、稳定的光信号强度.但由于有机染料荧光强度低、易发生光漂白,限制了单个有机染料标记靶目标检测时分析灵敏度的提高.为了解决这一问题,采用信号扩增技术,即多个荧光探针标记物对单个靶分子同时识别.这样能够增强荧光信号的强度,提高灵敏度,实现超灵敏分析.典型的高灵敏的分析标记物包括酶、或者它们的聚合形式、以及功能化的纳米粒子比如染料填充的纳米粒子、金纳米粒子、量子点(QD).尽管这些技术起了很重要的作用,但是这些技术标记的信号放大能力仍然是有限的.

特定核酸序列的扩增是分子生物学的一项基本技术.其中,滚环扩增(RCA)技术凭借其高特异性、高灵敏度和易操作性在近几年中逐渐引起人们的注意,并越来越多的用于基础研究和临床诊断分析及医药领域中.与其他核酸扩增技术相比,RCA技术具有高灵敏度、高特异性、多元性和高通量、等温反应和操作简单等优势.

随着核酸序列越来越多的被应用于生物蛋白质标记物,本章中,为了发展具有最大信号放大功能和最小非特异性吸附的信号标记物来高灵敏的检测蛋白.我们首次报道了一种基于磁纳米颗粒富集DNA的RCA扩增免疫分析新方法用于蛋白检测,磁纳米颗粒-RCA免疫分析方法,该方法出示了很多优点:(1)磁分离技术的运用明显的降低了磁纳米颗粒免疫探针的非特异性吸附:(2)三次信号放大技术(磁纳米颗粒富集DNA引物、RCA放大、荧光DNA纳米标签荧光放大)的联用极大的提高了方法的灵敏度.另外,该技术方法可以比较容易的制备卸载DNA的抗体检测试剂和并且操作比较简单.因此,发展的该免疫分析方法将成为一种强有力的工具用于高灵敏的蛋白检测.在对数范围内,荧光强度与人IgG浓度的成线性关系,并且动态范围从1×,10-12mol L-1-1×,10-17molL-1超过6个数量级.线性相关系数为0.997.检测限达到8.3×,10mol L-1(采用3倍的信噪比).实验证明,该方法具有较宽的动态范围,超高灵敏度、可接受的重现性、好的特异性和较低的基质效应影响.该技术作有望成为一种超灵敏的蛋白质检测技术用于蛋白质组学和临床诊断.

4、基于核酸外切酶辅助的免分离和内切酶介导的循环放大荧光法检测凝血酶

核酸适配体作为一种分子识别元件,越来越受到人们的关注,目前,应用核酸适配体荧光检测蛋白主要是基于适配体与目标蛋白作用后产生的荧光偏振度或荧光强度的改变来检测蛋白.这类方法也是信号变化范围较小,荧光背景较大,线性范围不宽,对于低浓度的蛋白测定存在一定困难.

核酸外切酶Exonucleasel (Exol)可以按照3’→5’方向水解单链DNA核苷酸,产生5’单磷酸脱氧核苷和末端二磷酸二核苷.核酸内切酶可以对双联DNA中某一段核苷酸基因位点进行特异识别切割,从而释放出靶目标物.本章基于此巧妙的设计了一段凝血酶的核酸适配体、将核酸外切酶和切割内切酶连用,发展了一种快速、高灵敏的基于核酸外切酶辅助的免分离和核酸内切酶介导的循环放大荧光法检测凝血酶.在这个方法中,我们首先合成一段含有凝血酶适体和一段含有识别序列的寡核苷酸即适体检测探针,当把探针与凝血酶一起孵育时,其可以识别凝血酶并与其结合.然后加入ExoI酶切除未结合的适体探针,而与凝血酶结合的探针则被保护下来;进而对被保护的探针的其中一段序列进行与分子灯塔MB杂交,从而打开分子灯塔发出荧光,然后加入切割内切酶去特定识别双联核苷酸的特定位点从而进行切割,释放出被保护的探针,在进行下一轮的循环放大.通过建立荧光强度与凝血酶浓度的相关曲线,我们可以实现对凝血酶的定量.检测限的灵敏度达到了5×,10-11mol L-1.实验证明,该方法具有高的灵敏度、可接受的重现性、好的特异性和较低的基质效应影响.该技术在改变相应蛋白的核酸适体情况下,有望用于对多种蛋白进行高灵敏和高特异性的检测.

5、基于RCA辅助诱导的G四倍体构型免标记荧光信号放大策略超灵敏检测DNA

G-四倍体DNA是由富含G的单链DNA,在特定的离子强度和pH条件下,单链内或单链之间对应的G碱基通过Hoogsteen氢键的配对,使4段或4条富G的DN*段相互结合形成一段四倍体DNA.卟啉衍生物(NMM),是一种阴离子卟啉化合物.能选择性的与G-四倍体DNA结合.游离的NMM发出很弱的光,但是在与G-四倍体DNA结合后展现出很强的荧光信号增强.

磁球是指含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应的高分子微球,它除了具有纳米颗粒的特性外,还可以通过表面的功能基团进行功能修饰.并因具有磁性,可在外加磁场的作用下方便迅速地分离.滚环复制(rolling circle replication)为噬菌体感染细菌后进行自我复制而普遍采取的一种形式.这种复制形式可在等温下以环状单链DNA为模板进行相对无限单链扩增,产生多个单元拷贝的长单链DNA分子.滚环扩增(RCA)即是基于这样一个原理的信号放大检测技术,有线性扩增和指数扩增两种形式.

为了设计方便、便宜、快速、易操作、灵敏度高、选择性好的核苷酸检测方法,本章基于卟啉衍生物(NMM)与G-四倍体DNA的相互作用,将其与RCA技术连用,巧妙的设计了两种免标记信号放大方法检测DNA,第一种:我们发展了一种基于磁纳米颗粒,核酸外切酶辅助循环放大和RCA扩增辅助的G-四倍体与卟啉衍生物(NMM)相互作用联用的的功能化传感器用于信号放大检测DNA.该方法应用了三次信号放大技术(磁纳米球富集、核酸外切酶辅助循环放大、RCA扩增放大),一方面提高了检测的灵敏度,一方面提高了方法的选择性.第二种:为了进一步简化实验步骤,缩短反应时间,避免污染,我们巧妙的设计了一种哑铃型的RCA模版、将卟啉衍生物(NMM)与RCA的产物(双向G-四倍体DNA)相互作用,发展了一种快速、简便、高灵敏的基于哑铃型探针诱导RCA扩增辅助的G-四倍体免标记荧光信号放大策略超灵敏检测DNA.

第二篇生物化学与分子生物学论文样文:功能型超分子体系的合成与自组装

1987年诺贝尔化学奖授予了C. J. Pedersen、J. M. Lehn和D. J. Cram三位科学家,以表彰他们在超分子化学理论与实践方面的开创性工作.从此之后,超分子化学作为一门新兴的边缘科学快速发展起来,并受到科学家们越来越多的关注,逐渐渗透到化学乃至科学界的各个领域,并发挥了不可估量的作用.2005年美国Science杂志在其创刊125周年纪念专辑中提出了21世纪亟待人们解决的25个重大科学问题,唯一与化学相关的问题就是“我们能够推动化学自组装走多远”,而化学自组装,也正是超分子化学研究中的关键问题.

从字面上看,超分子化学可定义为“超越分子的化学”,是关于若干化学物种通过分子间相互作用,包括氢键、主客体作用、疏水-疏水作用、静电作用、π-π堆积等作用结合在一起构筑的、具有高度复杂性和一定组织性的整体化学.由于并非通过共价键连接,所以整体中各组分在一定程度上还保持某些固有的物理和化学性质,同时又因彼此间的相互影响或扰动而表现出某些整体的功能.

超分子的概念目前已经渗透到生物学、材料学以及物理学等领域并且随之一起发展,构成了超分子科学(supramolecular science)和超分子技术(supramolecular technology),而超分子科学的明显成就就是导向信息科学,其表现是有组织的、复杂的和适应的,研究领域从无生命到有生命.这个领域发展如此之快,以至于科学家在积极工作的间隙也在驻足冥想,并提出:“超分子化学,目前在哪里,将要去何方”这也是20世纪最后一届",Supramolecular Science: Where It Is and Where It Is Going",(1998年)会议的主题.超分子化学之父J. M. Lehn教授曾提出了超分子化学相关的三个主题:信息和纲领性(information and programmability),动态和可逆性(dynamics and reversibility),联合性质和适应性(combinatorial feature and adaptability).

超分子科学同时也是研究生物功能、理解生命现象、探索生命起源的一个极其重要的研究领域,同时又是一个发展迅猛、充满活力的领域,其交叉学科的本质引起了物理学家、理论学家、晶体学家、无机固态化学家、有机合成化学家、生物化学家以及生物学家的广泛关注

本文主要关注的是超分子化学中最为重要的研究方面—超分子自组装.自组装行为在我们日常生活中随处可见,大至星系、云彩、矿产的形成,小至植物的生长、细胞器的构筑等.超分子自组装行为是如此的普遍,如果我们对自组装行为进行功能化以体现人为意志,将会产生其他行为手段所不能达到的效果,将对目前主要研究对象为共价键连接物质的化学界甚至科学界产生震动式的影响.超分子功能化自组装将打破共价键合成化学对各个领域(尤其是材料领域)近百年来的“垄断”.超分子功能化自组装,无疑是一个充满严峻挑战的课题,更是一个有着广阔作为的研究领域.

本论文主要由六部分组成,其具体内容如下:

(1)发展了基于超分子催化合成苯并呋咱-N-氧化物的新方法:在中性室温水体系中,环糊精作为纳米反应器超分子催化邻硝基苯胺的氧化,环糊精可回收使用,在后续的催化过程中催化效果未见降低.在核磁氢谱、红外吸收光谱对比的基础上,对此反应的机理进行了合理的猜测:环糊精通过氢键作用和和疏水-疏水作用与邻硝基苯胺自组装成超分子复合物,在这里环糊精不仅仅起了超分子相转移催化剂的作用,更是通过氢键作用和空腔保护了生成的苯并呋咱-N-氧化物,防止其被过度氧化.超分子功能化自组装即体现在形成的超分子复合物过渡态上.总之,我们革除了酸碱、有机溶剂的使用,提供了一种合成苯并呋咱-N-氧化物的绿色新途径.另外,对传统的贝鲁特反应进行了较大幅度的改进,使其更接近绿色化学的范畴.在良好的收率前提下在水相中进行了贝鲁特反应,环糊精可回收使用,在后续的催化过程中催化效果未见降低.在核磁氢谱1HNMR)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和紫外可见光谱(UV-vis)实验结果的基础上,对此反应的机理进行了合理的猜测.规避了有机溶剂在反应中的使用,进而规避了爆炸的风险,是一条实际操作性较强的路线.另外,在超分子催化领域,首次提出了“共价效应”.

(2)研究了一类新型表面活性剂—‘超分子型表面活性剂”的设计、制备、表征和应用.合成了九种蒽醌烷胺基的衍生物;指出了要形成“超分子型表面活性剂”所需的烷基链长度.利用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy, TEM).扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)、动态光散射(dynamic light scattering, DLS)以及荧光共聚焦显微镜(epi fluorescence microscopy, EFM)对“超分子型表面活性剂”自组装形成的囊泡体系进行了充分的表征,其中EFM是首次被利用来表征荧光型囊泡,并观测到了囊泡明显的布朗运动.在实验基础上提出了基于这种“超分子型表面活性剂”在溶液中构筑成为囊泡的机理过程,并指出超分子包结作用是“超分子型表面活性剂”乃至于其构筑的囊泡相的关键因素.基于对囊泡形成机理的考虑,指出这种囊泡应该是多重响应性和敏感性的,并利用其对外加H+,Cu2+以及外源竞争性客体分子的响应来进行了验证.利用其多重响应性、敏感性与荧光型,实现了对活细胞的荧光染色,效果良好.这是囊泡首次被用来进行细胞染色,也是囊泡为数不多的真正实际应用的例子之一.

(3)合成了一种具有独特结构的新型蒽醌衍生物,有可能在染料行业上有特殊应用价值.利用这种蒽醌衍生物作为超分子客体,首次研究基于“超分子型表面活性剂”的pH可逆型囊泡体系.利用TEM、SEM、 DLS以及EFM对制备的囊泡体系进行了充分的表征.利用UV-Vis.荧光吸收光谱、1H NMR以及二维核磁氢氢相关技术,提出了基于这种“超分子型表面活性剂”在溶液中构筑成为囊泡的机理过程.通过改变pH值可以控制囊泡的形成与消失,并且过程可逆.这个独特的性质将在智能材料设计、靶向释药等领域广泛应用.成功地将此囊泡体系应用到对癌细胞的染色领域,这个体系比原有染色体系有了更大的改进与提高,其实用价值更为明显.

(4)合成了新型的β-环糊精衍生物,成功的将具有强烈荧光性的蒽醌基团通过已二胺偶联在环糊精上,这种分子在荧光探针领域可能也有着广阔的应用前景.它可以在水溶液中通过π-π堆积和氢键作用的形式形成纳米棒,并通过UV-vis和二维氢氢相关(2D NMR ROESY)探究了产生这种现象的原因.通过加入等摩尔量的p-环糊精,原来的纳米棒可以逐渐转变成囊泡相.对于囊泡,我们利用TEM、SEM、DLS以及EFM进行了表征,并且在利用EFM进行表征的时候发现并首次报道了有趣的十字花现象.利用UV-vis、2D NMR ROESY、1HNMR以及FT-IR对这个转化过程进行了机理研究.研究了囊泡体系的响应性,指出了Cu2+或H+对于囊泡的形成均是不利因素,并且利用UV-vis对此机理进行了研究.设计的这个体系可能在具有可控和规则形貌的智能材料、分子机器设计、生物材料、生命过程模拟以及靶向释药等领域有着广阔的应用.

(5)利用乙二胺偶联,合成了另外一种新型的环糊精和蒽醌的偶联化合物,可在水溶液中自组装成囊泡,对囊泡进行了TEM、SEM、EFM及DLS等的充分表征.通过UV-vis、2D NMR ROESY及分子动力模拟给出了囊泡的形成机理.这种囊泡对H+和Cu2+具有刺激响应性,在紫外可见吸收光谱的实验结果给出了相应的机理.这种双层膜上固载有大环化合物的囊泡体系可以增溶和负载疏水性的紫杉醇分子,负载效率大概为50%.对环糊精衍生物和紫杉醇的超分子复合作用进行了研究.在1H NMR、2D NMR ROESY、FT-IR及XRD的实验结果上,提出了这种囊泡体系负载紫杉醇的机理.以两种人肝癌细胞为例,对这种负载有紫杉醇的囊泡体系的抗癌效果进行了研究,该体系在紫杉醇有效浓度低的情况下,却有更好的抗癌活性,说明这是一种高效的运输和治疗体系,并对该囊泡体系提高药物效果的原因进行了大胆推测.

(6)成功合成了三种基于萘基团的偶氮笼锁化合物,并优化了反应过程.研究了此类化合物结构与功能之间的关系,发现偶氮基团连在萘的α位可有效地降低激发能量,进而可以改进所需激发光的波长,降低构型反转所需能量.成功的将所需要的激发光的波长区域转移至可见光区,使构型反转所需能量大幅降低,这将大大拓展此类化合物生物学上的应用范围.另外磺酸基的引入,大大提高了此类化合物的水溶性,基本实现了在水相中利用可见光操控此类分子.

本论文的主要创新点如下:

(1)利用超分子催化,将原来只能在有机相中发生的反应成功转移到水相中,大幅度优化了反应条件,催化剂还可以重复使用,符合绿色化学的要求,在能源和资源日益紧缺的今天显得尤为重要.在此基础上,首次提出了超分子催化中的“共价效应”.

(2)研究了基于新型敏感型“超分子型表面活性剂”的敏感型囊泡体系,包括设计、客体分子合成、囊泡制备及表征、机理提出及验证、细胞染色领域的应用等.提出了“敏感型”囊泡体系的概念及成因,首次将囊泡体系应用于活细胞染色体系.

(3)首次研究了基于“超分子型表面活性剂”的pH可逆型囊泡体系,进行了充分的形貌表征,提出了囊泡形成及pH可逆的机理,并将此体系应用于癌细胞的染色领域.这种pH可逆型囊泡体系将在抗癌药物的负载及靶向运输领域有潜在应用.

(4)合成了新型的蒽醌-环糊精偶联体系,并研究了其在水溶液中的自组装行为:在室温下可以自组装成规整的纳米棒的形态,并且在外加母体环糊精的诱导下,该纳米棒状结构可以转变成囊泡相.该研究将在人为可控形貌的材料制备、分子机器设计等领域有着广泛应用.

(5)合成了另一种新型的蒽醌-环糊精偶联体系,并研究了其在水中的自组装行为.对其自组装的囊泡进行了充分表征和机理探讨.成功地将疏水性极强的抗癌药物紫杉醇负载到此囊泡体系中,并且发现这种负载药物的囊泡对癌细胞的杀灭效果非常好.这会对新型载药体系的设计有所启发.

(6)合成了新型的光控笼状分子,对质子的光控制释放研究提升了新台阶:成功地将原来仅对紫外光区响应的光控笼状分子光响应能量降低到可见光区,并大幅度提高了其水溶性,革除了惯用的乙腈溶剂体系,这将大大扩展可光控释放质子以调节溶液pH的笼状分子在生物学上的应用范围.

第三篇生物化学与分子生物学论文范文模板:基于化学生物学的中药有效成分牛蒡子苷元等的作用靶点及体内分布研究

化学生物学是一门用新颖的化学方法来阐释和操纵生物系统,研究生物学现象,解决现实世界中的生物学问题的学科.近十年来,化学生物学得到长足的发展,其影响已经拓宽到了更广泛的学科领域.中药的化学生物学将传统的基于结构的中药化学成分研究,引入到“生物学活性”研究的新层面,在分子靶标和作用机制的基础上,阐释有效成分的核心结构与其靶标蛋白的作用关系.然而中药药效成分的体内吸收、代谢和分布等具有复杂性,通常其在体内又具有“多重靶点”的特性,这就给中药的化学生物学研究带来了很大的挑战.为了建立中药药效成分的化学生物学研究平台,本论文分别选择了牛蒡苷元和甘草次酸作为实例,展开了作用靶点确证和代谢分布的化学生物学研究.

本论文首先采用悬浮聚合技术制备了聚乙烯醇磁性微球,开展了基于点击化学反应捕获靶标蛋白的磁性捕获技术的研究.一方面以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,采用荧光素以及叠氮对其进行了双标记;另一方面通过逐步反应将磁球的端位引入了炔基基团,中间修饰了二硫键结构;使得该磁球可以基于点击化学的方法特异性的捕获叠氮修饰的BSA,又可以通过还原二硫键而将捕获蛋白解离下来.以此为模型通过荧光共振能量转移的方法来检测磁球捕获的蛋白的能力,并通过响应面设计对微球的粒径和官能团覆盖度等参数进行了优化.结果显示,最佳性能磁球的粒径范围为1.25-6.31μm,官能团覆盖度范围为48.53-73.05%,其捕获蛋白能力最强,约每毫升磁球捕获67.07μg的BSA,与实际捕获量(63.92±,0.18μg)非常接近,证实了模型的可靠性并可以进行特异性靶标蛋白的富集.

其次,本论文利用叠氮标记的非天然糖1,3,4,6-O-乙酰N-叠氮乙酰胺(Ac4ManNAz)孵育人肺腺癌A549细胞,通过代谢标记手段产生了叠氮标记的糖蛋白,再使用上述炔基修饰的磁球对其进行捕获分离.发现1mL磁球可以分离得到51μm细胞表面糖蛋白,验证了基于点击化学方法捕获糖蛋白的可行性.在此基础上本论文制备了叠氮修饰的聚乙烯醇磁球和炔基化修饰的牛蒡苷元,通过点击化学反应,针对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)开展了捕获牛蒡苷元靶蛋白的研究.PharmMapper数据库的靶标预测结果显示,牛蒡苷元抗炎靶点可能为3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1).经SDS-PAGE电泳和western blot分析,利用抗PDPK1抗体验证了PDPK1蛋白大量存在于所磁性捕获的蛋白中.进一步结合分子对接及分子动力学分析,证实牛蒡子苷元与已知的PDPK1抑制剂253具有相近的作用方式及作用强度,初步确认PDPK1为牛蒡子苷元的作用靶点之一,为深入研究牛蒡子苷元的作用机理打下基础.

为了改善磁球捕获靶蛋白技术在组织细胞定位观测以及在蛋白捕获量上的局限性,本论文进一步又设计了一种新颖的聚赖氨酸自组装荧光纳米球,经透射电镜形态观察该微球大小均匀,粒度分析结果表明平均粒径为38nm.经酶标仪荧光检测,552nm激发波长下,其最大发射波长为596nm,荧光强度可以达到相同浓度Rhodamine溶液的两倍,提高了捕获载体的生物相容性、荧光可示踪性以及捕获分离的便捷性.进一步对其进行了叠氮功能化修饰,并通过点击化学反应与炔基牛蒡子苷元结合,制备了连接有牛蒡子苷元的荧光纳米球.将上述微球通过尾静脉注射用于急性肺炎小鼠,进行活体成像分析,发现其胸腔的浓度明显升高;离体各器官的荧光强度测定也显示,模型组小鼠肺部的荧光强度可以达到其它器官的2倍以上,证实了牛蒡子苷元的靶点主要集中在肺部.利用人支气管上皮BEAS-2B细胞开展牛蒡子苷元的细胞成像研究,发现结合有牛蒡子苷元的荧光纳米球在细胞内有结合特异性,证明牛蒡子苷元的靶点主要分布在胞浆中.

利用上述合成的连接有牛蒡子苷元的聚赖氨酸荧光纳米自组装纳米球以及空白纳米球,分别对BEAS-2B细胞中的靶蛋白进行了捕获研究.经过流式细胞分析,确定了共同孵育3h为最佳的捕获时间;通过裂解细胞和超滤对捕获蛋白进行富集,并经DTT还原和超滤浓缩得到了相应的结合蛋白.SDS-PAGE电泳分析显示,阳性蛋白富集率远远高于和阴性蛋白.经HPLC-MS/MS鉴定,阳性组共鉴定出675种蛋白,阴性组为750种蛋白;使用Protein Score和Coverage软件进行条件过滤,发现其中阳性样品中有19种蛋白,阴性样品中有14种蛋白为可能的目标蛋白;进一步采用生物信息学工具String9.0和KEGG对目标蛋白的相互作用关系进行分析,最终将阳性蛋白样品划分为4个功能组,分别与能量代谢、炎症、钙调节和热休克等功能相关;而阴性样品只能划分出1个细胞骨架调节蛋白组,证明为非特异性吸附的蛋白.进一步通过AutoDock4.0软件将上述阳性蛋白与牛蒡子苷元进行分子对接,确认其可能的蛋白靶点.筛选结果表明,牛蒡子苷元对肽基脯氨酰异构酶(PPIA),热休克蛋白70(HSPA8),肌动蛋白γ1(ACTG1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等显示出较强的结合力,结合能分别为-7.89,-7.62,-7.27和-7.22kcal/mol,并存在合理的氢键结合,证实了牛蒡子苷元的作用靶点为PPIA,HSPA8,ACTG1和GAPDH,分别与胞内钙离子、热休克抑制、炎症通路和调控能量代谢相关.

最后,本论文围绕桔梗“引经报使”改变甘草的药效分子甘草次酸的动态分布过程开展化学生物学研究.分别对甘草次酸进行衍生化,制备可用于甲苯磺酰氯亲核取代进行放射性18F标记的前体衍生物,并对其18F标记条件进行探索.结果发现,通过羧基衍生的直链羟基取代后再进行亲核取代,利于18F-甘草次酸的合成,产率为16.9%,放射性强度为150mCi,放射化学纯度为98.6%.以此为基础建立了基于PET的甘草次酸药代分布研究模型,以口服桔梗总皂苷进行干预,再通过小鼠尾静脉注射18F-甘草次酸,分别对主要器官的血药浓度进行了在线活体的观测.经数据分析发现,在注射前一次性灌胃给桔梗总皂苷(50g/kg)组,从给药7min开始至115min,肺部18F-甘草次酸的浓度明显升高,为对照组的2.7倍,而其它器官没有明显的变化,印证了桔梗能够引甘草上行的观点.而在注射前一周每天灌胃给药上述相同计量的桔梗总皂苷,注射当天停止给药,同样观察药代分布变化,结果发现几乎没有改变甘草次酸药代分布的效果.因此推测,可以是药物相互作用的原因改变了甘草次酸的药代分布,具体分子机制还有待进一步研究.

本论文采用了点击化学、磁性捕获、纳米自组装以及PET成像等重要的研究手段,分别对牛蒡子苷元的组织分布、细胞定位、以及靶点蛋白捕获以及桔梗引甘草上行的机制等进行了研究,初步建立了筛选和鉴定细胞内的靶点蛋白,并通过生物信息学分析、分子对接和基于结构的计算分析手段确证相应的靶标蛋白及其生物学功能,以及开展相关代谢分布研究的中药化学生物学方法,为在分子层面揭示药效分子的作用机制奠定了基础.

第四篇生物化学与分子生物学论文范例:数据挖掘方法用于参与代谢的小分子生物学功能预测研究

代谢是新陈代谢的简称,是一系列作用于细胞中的化学反应的总和,楚生物体维持生命的化学反应的总称.代谢反应使得生物体得以生长和繁殖,保持生物体的结构,并能对环境作出反应.小分子参与了代谢反应的整个过程.小分子是分子量比较小的天然化合物,通常是指相对分子质量小于1000道尔顿(尤其是小于400道尔顿)的生物功能分子.小分子可以参与包括代谢反应在内的很多生物过程,据估计,与生物过程有联系的小分子的祌类数目至少有10万多个,而迄今为止己搞清楚其生物学功能的尚不足其中的1%.因此,进行小分子的生物学功能识别和预测研究,有助于理解生命过程中一些问题的生物学和化学本质.然而目前小分子的生物学功能研宄缺少成熟的研宄方法和技术,对于其认识大多来源于专家经验,而使用大规模的实验手段鉴定小分子的生物学功能,需要耗费大量的时间、人力和物力.值得庆幸的是,通过搜集整理小分子生物学功能研宂的实验成果,利用数据挖掘方法总结已知数据中隐含的规律1进而预测未知小分子的生物学功能,由此可以提供除了专家经验以外的另一种途径,

使用数据挖掘方法进行小分子的生物学功能识别和预测研宂.首先要解决的问题就是如何对小分子进行参数表征,这对于数学模型的建立起到至关重要的作用.经过比较现有的商业和开源的分子描述符计算程序,选用了ChemAxon公司的Calculator Plugins等程序,使用Java语言对其进行了二次幵发,幵发了一个方便易用且可自行定钊的批量计算小分子的分子描述符的计算程序.程序极大地提髙了小分子的分子描述符计算的便捷性和计算效率,为小分子的生物学功能识别和预测研究提供了高效的工具.

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正确有效地把具-有重要生物学意义的小分子映射到其相对应的代谢途径,将有助于人们更加深入地进行代谢分析,更为深刻地理解小分子的代谢机理》使用ChemAxon公司的JChem for Excel软件批量计算小分子的分子描述符*基于mRMR算法(minimum Redundancy Maximum Relevance)和FFS算法(Feature ForwardSearch)进行特征选择,采用以C4.5决策树算法为基本分类器的Ackboost算法预测了小分子可能参与的代谢途径的类型.由此所建立模型的10折交叉验证测试和独立测试集测试的预测正确率分别为83.88%和85.23%,与使用官能团组成表征小分子的方法相比,预测结果有了显著的提高.还使用HyperChem软件计算小分子的分子描述符,基于CFS (Correlation-based Feature Subset)算法进行特征选择*采用以最近邻算法为基本分类器的Bagging算法预测了小分子可能参与的脂类代谢的子代谢途径,所建模型对Jackknife交叉验证和独立测试集的预测正确率分别是89.85%和91.46%.

在代谢途径中,小分子通过与酶的相互作用,参与了整个代谢过程.研宂小分子与酶的相互作用,可以根据己知的",小分子-酶作用对”预测未知的小分子和酵能否相互作用,进而为探索各种代谢或催化机理提供新的研宂思路.使用所开发的计算程序的计算结果表征小分子,使用改进的拟氨基酸组成表征酶,对代谢途径中小分子和酶的相互作用进行研宄.结合使用mRMR算法、IFS (IncermentalFeature Selection)算法和FFS算法进行特征选择,釆用最近邻算法进行建模,其10折交叉验证测试和独立测试集测试的预测正确率分别为85.19%和85.32%,其中正样本的预测正确率分别为86.02%和86.74%,与前人的研宄工作相比,正样本的预测正确率有较大的提高.

使用*法对蛋白质与RNA的相互作用进行了研宂,有关研宄结果有助于理解蛋白质如何控制基因表达.从Weka软件中选取了34种分类算法,建立了四种*系统.结果表明,*法的预测结果优于单一分类算法的预测结果,并且使用算法选择和对算法进行加权可以优化预测结果.使用含算法选择的加权多数*系统取得了最佳的预测结果,独立测试集测试的平均ACC (overall predictionaccuracy)值和平均MCC (Matthew',s Correlation Coefficient)值分别达到82.04%和64.70%

第五篇生物化学与分子生物学论文范文格式:短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的生物化学、药理学和分子生物学的研究

目的蛇毒是一种含有多种蛋白和多肽的混合物,其中不少毒性蛋白影响凝血功能(血液凝固、纤溶系统和血小板聚集),这些毒素是蛋白质或酶.如L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A、核苷酸酶、类凝血酶、纤溶酶、蛋白酶C,而有些是非酶蛋白,如解离素、Carinatin、Trigramin.它们的各种有效成分和性质也被广泛研究.然而,蛇毒中所含磷脂结合抗凝蛋白的研究尚未见报道.本课题的目的旨在从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂结合抗凝蛋白(Phospholipid-binding anticoagulation protein(PBAP),并对它的一些生化、物理性质,对动物体内外的抗凝血、抗血栓、血液流变学作用,一般药理和毒理,作用机制以及基因克隆进行研究.从而通过生物学的方法得到电泳纯、有活性的磷脂结合抗凝蛋白,为制备安全、有效的新型溶栓制品打下良好的基础.

1方法

1.1短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的纯化和鉴定:采用阳离子交换剂CM-Sephadex C-25、阴离子交换剂DEAE-Sepharose CL-6B,凝胶过滤剂Sephacryl S-200、Sephadex G-75层析的方法进行分离和纯化磷脂结合抗凝蛋白:用活化的部分凝血活酶时间(APTT)测定其抗凝活性,以专一性酶测定方法测定其酶活性,用SDS-PAGE电泳检测其蛋白相对分子质量,用等点聚焦测定其蛋白等电点,用Dittmer',s的簿层层析方法测定抗凝蛋白与磷脂结合,采用Edman降解法测定其氨基酸序列.

1.2短尾蝮蛇蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响:

1.2.1活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)含量测定

1.2.1.1体外法:0.2 mg/ml的磷脂结合抗凝蛋白0.1ml,分别与1、2、4、6、8ml正常人混合血浆配置成1:10、1:20、1:40、1:60、1:80不同稀释浓度,每一稀释浓度取0.05ml,然后按APTT、PT、TT、FIB试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行.

1.2.1.2体内法:新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组.各兔于耳缘静脉按0.8、0.4、0.2 mg/kg给药,肝素组剂量为50U/kg,药前及药后15min分别从耳动脉取血2ml,用3.8%枸橼酸钠9:1抗凝,3000转/ml离心10min,分离贫血小板血浆,按APTT、PT、TT试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行测定.

1.2.2凝血因子活性的测定

1.2.2.1体外法:0.2 mg/ml的磷脂结合抗凝蛋白0.1ml,分别与1、2、4、6、8ml正常人混合血浆配置成1:10、1:20、1:40、1:60、1:80不同稀释浓度,每一稀释浓度取0.05ml,用因子缺乏血浆作为标准,按Triplett建立的方法进行凝血因子FⅡ:C,FⅤ:C,FⅦ:C,FⅧ:C,FⅨ:C,FⅩ:C,FⅪ:C,FⅫ:C的活性测定,并计算抑制率.

1.2.2.2体内法:新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组.各兔于耳缘静脉按0.8、0.4、0.2 mg/kg给药,肝素组剂量为50U/kg,药前及药后15min分别从耳动脉取血2ml,用3.8%枸橼酸钠9:1抗凝,3000转/ml离心10min,分离贫血小板血浆,按凝血因子试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行各凝血因子测定.

1.3短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对动物血栓的抗栓作用:用Chandler法制备家兔体外血栓和半体内血栓模型,用Reyers法制备大鼠静脉血栓模型,用Nowork法制备家兔肺动脉栓塞模型.测定磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓,半体内血栓,肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓的抗栓效应.

1.4短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白对动物血液流变学的影响:采用LBY-N6A自清洗旋转式粘度计测量家兔全血黏度、红细胞压积等指标.

1.5短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的一般药理作用:

1.5.1小鼠尾静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后观察其一般行为、协调活动和对阈下戊巴比妥钠的催眠作用.

1.5.2家兔静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后,观察家兔的心率、心电图、平均动脉压、呼吸频率等指标.

1.6短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的急性毒性实验:用Bliss方法计算静脉注射和腹腔注射两种给药途径的LD_(50)及95%的可信限.

1.7短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的基因克隆和序列分析:从蝮蛇的毒腺中抽提总RNA,采用RT-PCR技术,用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒扩增DN*段,将PCR扩增产物克隆至原核载体PMD-19T载体,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落提取质粒,用PCR对其进行鉴定,直接利用纯化PCR产物和提取阳性菌落质粒进行测序.

2结果

2.1采用离子交换、凝胶过滤等方法从短尾蝮蛇中分离纯化出的抗凝蛋白是二聚体,相对分子质量为24.0×,10~3(非还原)和14.6×,10~3(还原).酸性氨基酸(天冬门氨酸,谷氨酸)的含量大于碱性氨基酸.等电点为pH 5.2.得率约占蛇毒总重量的0.421%.该蛋白具有精氨酸酯酶活性,能明显地延长活化的部分凝血活酶时间(APTT),抗凝活性在pH 6-9的范围内稳定.氨基酸N-末端序列由D-C-P-S-(D/G)-W-S-S-Y-E-G-H-C-Y-(Q/K)两条肽链组成.能够与磷脂结合,称为磷脂结合抗凝蛋白.

2.2磷脂结合抗凝蛋白体内外有明显的抗凝血作用.

2.2.1磷脂结合抗凝蛋白体内外能显著地延长APTT:0.2mg/ml的抗凝蛋白与30份正常人血浆以1:80、1:60、1:40三种不同浓度稀释,每一稀释浓度取50μl进行试验,结果表明:三种浓度抗凝蛋白体外对APPT的影响分别为57.54±,2.66、74.77±,7.18、107.92±,11.4秒与对照组37.43±,2.03秒相比有显著性差异(P<0.01),抗凝蛋白浓度越高,其抗凝活性越强.这种作用与温育时间无关.家兔体内抗凝试验也表明:0.8、0.4、0.2mg/kg大中小剂量的磷脂结合抗凝蛋白药后15min的APTT为116.94±,38.19、87.27±,7.13、76.07±,11.66秒,均比药前的53.82±,1.96、54.77±,5.75、57.95±,12.24秒明显延长(P<0.01或0.05),且有剂量依赖性,中等剂量抗凝蛋白对APPT的作用与50U/kg肝素相似.它不影响凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT).

2.2.2在TTI抑制试验中,当抗凝蛋白为4.4μg/mL浓度时,在APPT试剂为1:100和1:1000稀释时,APPT分别为54.7秒(对照48.7秒)和176.8秒(对照137.7秒)表明用高稀释度的APPT试剂时,减少TTI试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用.在稀释的罗氏蝰蛇毒时间测定中,亦可看到在抗凝蛋白浓度为2.2μg/mL和4.4μg/mL正常混合血浆时,罗氏蝰蛇毒时间分别为47.7秒和56.5秒(对照41.5秒),表明在抗凝蛋白的作用下,稀释的罗氏蝰蛇毒时间较对照(41.5秒)明显延长,而且与剂量成正比.其抗凝活性与磷脂结合有关.

2.2.3磷脂结合抗凝蛋白干扰凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性体外凝血因子试验表明:1:60和1:80稀释度仅抑制FⅨ:C因子活性,1:10、1:20、1:40稀释度则可抑制FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C、FⅫ:C的活性.兔体内凝血因子试验也表明:0.8、0.4mg/kg两剂量磷脂结合抗凝蛋白药后15min均可抑制FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C、FⅫ:C的活性,抗凝蛋白浓度与因子抑制活性呈正相关.

2.3磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓,半体内血栓,肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓均有明显的抗栓效应

2.3.1磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓模型有明显的抗栓效应:0.62mg/ml磷脂结合抗凝蛋白50、30、10μl可使家兔体外血栓的干重由对照组的23.7±,2.1mg减轻至0±,0,15.4±,2.2,18.54±,1.9mg(P<0.01>,.湿重由对照组132.7±,10.5 mg减轻至0±,0,72.9±,12.3,96.4±,12.1mg(P<0.01).

2.3.2磷脂结合抗凝蛋白对家兔半体内血栓模型有明显的抗栓效应:磷脂结合抗凝蛋白0.8、0.4、0.2mg/kg各剂量组药后5、15、30、45min与药前组比较,各剂量组血栓的干、湿重量均比药前组减轻(P<0.01-0.05).其中以5min减轻最明显.

2.3.3磷脂结合抗凝蛋白对大鼠静脉血栓有明显的抑制效应:生理盐水组血栓形成率均为100%,磷脂结合抗凝蛋白组(0.8mg/kg)大鼠静脉血栓形成率均为0%,差异显著(P<0.01).

2.3.4磷脂结合抗凝蛋白对家兔肺动脉栓塞有明显的抗栓作用:与对照组相比,给药组(0.4mg/kg)药后24h栓子减少32.26±,2.23mg,对照组给生理盐水后24h栓子减少4.46±,0.55mg两者比较有显著性差异(P<0.01).

2.4短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白具有明显降低家兔血液流变的作用:0.4mg/kg磷脂结合抗凝蛋白静脉注射于家兔后与阴性对照组相比,低切、中切、高切变率下家兔的全血粘度分别降低0.91±,0.31、0.51±,0.11和0.39±,0.08(p<0.05>,而红细胞压积显著降低4.00±,1.41%(P<0.01).

2.5短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的一般药理学研究表明:小鼠尾静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后,磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的一般行为、协调活动和对阈下戊巴比妥钠的催眠作用以及各组剂量磷脂结合抗凝蛋白对家兔的心率、心电图、血压以及呼吸频率等均无影响.

2.6短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的急性毒性实验:小鼠静脉注射磷脂结合抗凝蛋白的LD_(50)为26.869mg/kg,95%平均可信限23.348~0.65mg/kg,腹腔注射磷脂结合抗凝蛋白的LD_(50)为39.897mg/kg,95%平均可信限35.948~44.128mg/kg.

2.7短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的基因克隆和序列分析:引物扩增得到一条特异性的DNA条带,大小为400 bp,将其进行克隆及测序,序列分析结果显示我们所得到的cDNA长599bp,其中编码框有441bp,编码由146个氨基酸组成的磷脂结合抗凝蛋白前体.其前体N端由23个氨基酸组成信号肽,由123个氨基酸构成的成熟磷脂结合抗凝蛋白质.

3结论

从短尾蝮蛇毒中分离纯化出的磷脂结合抗凝蛋白是二聚体,相对分子质量为24.0×,10~3(非还原)和14.6×,10~3(还原).等电点为pH 5.2.得率约占蛇毒总重量的0.421%.该蛋白具有精氨酸酯酶活性,能够与磷酯结合.能显著地延长活化部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间,减少组织凝血酶抑制试验(TTI)试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用,它干扰Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性,可能通过内源性途径抑制凝血过程.它明显降低家兔全血粘度和红细胞压积.对家兔体外血栓,半体内血栓,肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓具有明显的抗栓作用.它不影响实验动物的神经系统、循环系统和呼吸系统,毒性低、无溶血、无出血活性.

通过基因克隆和序列分析表明:它与已报道的一些蛇毒凝集素氨基酸序列相比较,有88%-99%的同源性.该蛋白具有潜在的临床应用价值.


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生物化学与分子生物学引用文献:

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[3] 生物化学与分子生物学论文大纲 生物化学与分子生物学论文提纲怎样写
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