有关简析间接血凝法测定乙型肝炎抗体实验毕业论文写作资料-论文写作网

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红细胞抗原论文范文

间接血凝法是将抗原吸附在红细胞上,当遇到血清中存在的少量抗体时即可发生红细胞凝集.抗原吸附至红细胞上的方法很多,可用鞣酸、氯化铬、对偶氮联苯胺、碳化二亚胺等处理红细胞,亦可用丙酮酸及甲酸固定红细胞后直接吸附抗原.将乙型肝炎抗体吸附至红细胞上的方法有用氯化铬作连接剂,亦有用鞣酸法、及直接致敏法.我们对鞣酸法作了以下实验.

1.实验方法

1.1 致敏羊红细胞的制备

（1）戊二醛固定羊红细胞：将沉淀或脱纤维羊血离心,弃去上清液,用10倍量生理盐水洗涤三次,用pH7.2P.B.S.配成5%红细胞悬液.5%红细胞悬液100毫升加入2.5%戊二醛20毫升,室温搅拌一小时,用生理盐水洗四次,用Ph7.2P.B.S.配成5%红细胞悬液,放冰箱内约可保存半年.

（2）鞣酸处理羊红细胞：5%戊二醛固定羊红细胞悬液10毫升加2.5毫克%鞣酸10毫升,放入37℃水箱10分钟后离心,以Ph7.2P.B.S.洗两次,以pH7.2P.B.S.配成2.5%红细胞悬液20毫升.

（3）抗原致敏：2.5%鞣酸处理红细胞悬液20毫升加纯化抗原20毫升,放入37℃水箱,每隔5分钟混匀一次.15-30分钟后离心,以pH7.2P.B.S.洗三次,加2%兔血清稀释液至5毫升使成10%红细胞悬液.保存冰箱约可保存半年.临用时用2%兔血清稀释液配成1%红细胞悬液.

1.2 实验操作

（1）在测定排中每孔加入2%兔血清稀释液0.025毫升,在对照排中加1:10稀释抗原0.025毫升.震摇混匀后盖上玻璃板一块,置37℃温箱一小时.

（2）每孔加1%致敏红细胞悬液0.025毫升,震摇混匀,静置室温2小时后观察结果.如血凝板孔底较尖,可加0.5%致敏红细胞悬液.

（3）每次测定同时作阳性、阴性及红细胞对照各一份.

2.实验结果

（1）羊红细胞对致敏的影响：从6头绵羊采得的血液分别按上法处理,所得结果无明显差别,但采血后保存时间不宜超过一星期,时间放置太长的红细胞,抗原就致敏不上.

（2）鞣酸浓度选择：将鞣酸用生理盐水配成25毫克/100毫升,5毫克/100毫升,2.5毫克/100毫升,1.25毫克/100毫升四种浓度,分别按上法处理羊红细胞及致敏抗原,结果说明鞣酸浓度在25毫克/100毫升时会引起红细胞自凝,而在1.25-5毫克/100毫克范围内所得结果一致,故选用2.5毫克/100毫升.

（3）致敏时间的选择：将已经鞣酸处理的羊红细胞按上法与纯化抗原在37℃水箱分别作用15分、30分及60分钟后进行测定,结果用不同时间致敏所得红细胞测定已知抗体,所得抗体滴度是一致的,故致敏时间在15-30分钟内已够.

（4）致敏红细胞浓度是选择：将10%致敏红细胞,用2%兔血清稀释液稀释成0.5%,1%,1.5%,2%后进行测定.结果表明致血红细胞浓度以1%左右较好,浓度太淡及太浓均影响结果观察.

（5）兔血清稀释液的最适浓度：以2%兔血清最好,仅在有抗体存在时出现凝集,当用1%兔血清或不加兔血清时则在正常人血清及对照孔中亦会出现血凝集.

（6）正常献血员乙型肝炎抗体分布情况：正常献血员104名,对流电泳法测定乙型肝炎抗原体及抗体均为阳性.用间接血凝法测定抗体以滴度1:8以上为阳性者共17名,阳性率为16.3%.

（7）实验病人乙型肝炎抗体分布情况：共检查了137名各期肝炎病人,其中对流电泳法乙型肝炎抗原阴性者84名,阳性者53名.对流电泳法检出抗体全部为阴性,用间接血凝法测定抗体,以滴度1：8以上为阳性者共七名,阳性表现率为5.1%.

3.结果讨论

（1）间接血凝法检测乙型肝炎抗体的灵敏度及特异性取决于抗原的纯度.用硫酸加热法及葡萄聚糖凝胶过滤法所纯化的抗原,因此纯化用血清中乙型肝炎抗原滴度必须不小于1:32,如抗原滴度太低会影响致敏.当用1:64的阳性血清纯化所得抗原,不浓缩时与兔抗人抗血清用免疫电泳法不出现沉淀线,致敏时又将此抗原再稀释10倍,因此致敏到羊红细胞上的抗原主要是乙型肝炎抗原.这种致敏红细胞与大多数正常人血清不凝集,而与已知对流电泳法测得乙型肝炎抗体滴度1:16的血清,血凝法滴度为1:2,048,因此可以认为其凝集是特异性的.当间血凝法滴度达1:128时,对流电泳法可出现沉淀线,其灵敏度比对流电泳法搞100倍左右.

（2）对照孔目的是检查结果是否准确,是特异性凝集还是非特异性凝集.每换一批抗原时要预先测定其抑制滴度.例如对一已知阳性抗体,测定孔滴度为1:256,对照孔加入一定量抗原后滴度为1:16,表示其抑制度为1:16.即标本中抗体滴度低于1:16时所加入的抗原可以把它抑制掉,对照孔不出现凝集.如标本中抗体滴度高于1:16时所加入的抗原就不能全部把它抑制掉,此时根据标本中抗体含量在对照孔可出现1孔至数孔凝集.如对照孔及测定孔均为1-2孔凝集,此凝集为非异性凝集.对照孔抗原亦可采用固定阳性血清代替,如阳性血清对流电泳滴度为1:8,则可将此血清1份加2%免血清稀释液7份混合后应用.