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1.辽宁省医疗器械检验检测院,辽宁沈阳 110179；2.沈阳药科大学,辽宁沈阳 110016
[摘 要] iTRAQ是2004年开发的一种新的同位素标记试剂,结合MRM技术已经被广泛的应用于细菌、酵母、体液、微生物、人体组织和细胞等多种样本的蛋白质鉴定、定量以及对目的蛋白的验证中.目前,由于iTRAQ能同时对2-8组样品进行标记分析并具有高通量、重复性、敏感性高等特点使其为进行纳米银生物医学材料毒性评估提供了有力的技术平台.
[关键词] 同位素相对与绝对定量技术；多反应监测；纳米银；蛋白质
[中图分类号] R341 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）12（b）－０196-03
[基金项目] 课题名称：新型及高风险医疗器械检测与安全价技术评价（2012BAI22B01）.
[作者简介] 刘赞（1976-）,女,辽宁沈阳人,博士,助理工程师,主要从事肺腺癌的发病机制研究及早期血清标志物探测.
[通讯作者] 余洋,（1976-）,女,辽宁沈阳人,硕士,副主任药师,主要从事医疗器械的生物学检测工作.
近年来研究蛋白质相对和绝对定量的常用质谱分析技术是同位素标记,如2004年开发的较新的技术iTRAQ等.采用iTRAQ进行蛋白质的相对和绝对定量,其结果可以得到500~600种蛋白.通过大规模数据分析,采用质谱多反应监测（MRM）对筛选出来的蛋白进行确证.MRM技术是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据,进行质谱信号采集的技术.目前,它已经成为生物标志物大规模临床确诊的主要手段.未来,iTRAQ 结合MRM 在探求未知复杂疾病领域中将成为一种有效性和可靠性较高的技术[2].
纳米技术是在0.1~100 nm 空间尺度内操纵原子和分子,研究物质的特性和相互作用,并利用这些特性的多学科交叉的一门综合性科学技术[3-4].然而,如何评价纳米材料的毒性和安全性还没有统一的标准.我国食品药品监督管理局报道,到目前为止我国已有188件国产纳米医疗器械和6件进口纳米医疗器械通过了国家局或省级药监局的审批进行临床应用[5].迄今,有关纳米银对人体的负效应,尤其是长期频繁或大量使用时的慢性毒性尚不清楚.因此,建立完善的既符合我国特点又与国际接轨的技术标准体系,保证其安全使用是至关重要的.
综上,该文就iTRAQ结合MRM技术及其在纳米生物医学材料毒性评估中的现状及进展进行综述.
1. iTRAQ技术特点和应用领域
1.1 iTRAQ技术特点
在一次实验中可同时标记2~8个样品,一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量,定性与定量同时进行；适用范围较广；所需样品较少,可处理微量样品；13C,15N,18O在 scx 或 RP预分离时,不会影响肽段的行为,任意肽段理论上都可能被标记,拥有极高的标记效率；每个蛋白都有多个肽段被标记,提高了鉴定和定量可靠性；平衡集团在质谱碎裂时会中性丢失,不争夺电荷,鉴定时,来源于不同样品的报告集团会分离得很清楚（113-121Da, skip120）,而来源于不同样品的相同肽段在质谱上表现为一同个峰,强度叠加可有效改善图谱鉴定,有利于鉴定.
1.2 iTRAQ的应用领域
iTRAQ试剂可用于标记不同性质的样品,如微生物（500 mg）,动物组织（500 mg）[6],植物组织（500 mg）[7],细胞（106~107）,体液（羊水,脑脊液,尿液等）,血清/血浆（200~300 μl）, 细胞器[8].iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,它可以检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、＜10 KD或＞200 KD的蛋白；可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；可以分析详细分期／型的临床疾病样本,并可设计样本重复；甚至可以进行个体样本的研究、细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态蛋白质组学的研究.在差异蛋白质组学研究中,iTRAQ技术可用来寻找生物标志物,进行时间过程样本分析,不同处理方法样本差异以及信号通路的研究.
2.MRM技术特点和应用领域
2.1 MRM技术特点
（1）灵敏度高：通过两级离子选择,排除大量干扰离子,使质谱的化学背景降低,目标检测物的信噪比显著提高,从而实现检测的高灵敏度.（2）重现性好：在MRM 技术选择性的质谱信号采集中,避免了待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响,因此重现性也相应提高.（3）准确度高：利用MRM技术的特异性,进行连续增强的离子扫描分析,得到高分辨的串联质谱（MS/MS）碎片数据,与全扫描和中性丢失质谱扫描模式相比降低了分析过程中定性结果的假阳性率,保证了分析的准确度.（4） 通量高：使用目前最先进的质谱系统,MRM技术每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子对,这种特点为研究多种蛋白质的多种修饰和丰度变化提供了机会,更能满足蛋白质组学的研究需求.
2.2 MRM的应用领域
生物标志物的研究是医学领域研究的热点.目前,标志物发现-验证-临床确证的研究模式已经得到广泛的认可.即在发现阶段从疾病组织中寻找与正常组织的差异蛋白质到到验证阶段使用MRM技术进行临床确证.MRM技术在验证和确证阶段都弥补了经典免疫学原理利用抗体进行验证确证的缺点,充分体现了该技术在生物标志物检测领域中的价值.
蛋白质翻译后修饰在许多生命活动的调节过程中起重要作用,例如,在蛋白质磷酸化修饰中,MRM技术在翻译后修饰的研究领域中显示了独特的特点和优势磷酸化蛋白质被酶切后,磷酸化多肽的信号淹没在大量非磷酸化多肽的信号中需要进行磷酸化富集来提高分析灵敏度,改善分析效果.MRM技术在定量蛋白质组学应用上也展现了其方法的优点.首先,在一定程度上提高了测定的动态范围其原因一方面是因为对离子的选择检出,降低了复杂组分的背景信号,增加了一些低丰度蛋白质的检测灵敏度；另一方面通过对高丰度、低丰度蛋白质MR离子对的选择来均衡两者的响应信号差异.例如,对高丰度蛋白质,选择响应丰度较低的母离子-子离子对；对低丰度蛋白质,选择响应程度较高的母离子-子离子对,从而均衡高、低丰度的信号差异.其次,减少了复杂组分流产物的干扰,增强了检测的特异性.此外,MRM技术高通量的特点,也为多种蛋白质的同时定量提供了条件[9].
3. 蛋白质组学在的纳米银材料中的研究进展
徐丽明等[10]早在2011年就已经进行了纳米银离子毒性评估的全基因组进行了研究,该结果表明,与纳米银接触24 h的Hela细胞中上调的基因涉及各种初级代谢过程,细胞进程和应激反应,这些基因的上调可归因于银离子的释放.而纳米银所致的基因下调也可归因于银离子的释放,但基因下调中大多数功能的改变要归结于纳米银本身.而接触48 h后基因改变的数目大幅下降,提示毒性反应是顺时的.然而,随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学的研究已经进入了后基因组时代,在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等.尽管现在已有多个物种的基因组被测序,但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的.目前功能基因组中所采用的策略,如基因芯片、基因表达序列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE）等,都是从细胞中mRNA的角度来考虑的,其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平.但事实并不完全如此,从DNA mRNA 蛋白质,存在三个层次的调控,即转录水平调控（Transcriptional control）,翻译水平调控（Translational control）,翻译后水平调控（Post-translational control）.从mRNA角度考虑,实际上仅包括了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平.蛋白质组与基因组的有许多差别,它随着组织、甚至环境状态的不同而改变,在转录时,一个基因可以有多种mRNA形式剪接,并且,同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰,故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目.
目前,在纳米银材料的研究中,Verano-Braga T[11]等人使用定量蛋白质组学方法研究纳米银离子引发的细胞内反应,结果表明,一些独特的细胞进程是由纳米颗粒的粒径大小决定的.如,100 nm 粒径的纳米银粒子是通serine/threonine protein kinase （P*）, mitogen-activated protein kinase （MAPK）和phosphatase 2A pathways 信号转到路径引发的直接效应,而20 nm粒径的纳米银粒子则直接诱导细胞应激反应,包括产生的活性氧和羰基化蛋白.此外,研究者还报道了有相关蛋白在给与20 nm粒径的纳米银颗粒之后呈明显上调并参与相扑化途径（SUMOylation pathway）. Mirzajani F[12]等人利用蛋白质组学方法研究了纳米银颗粒对水稻的毒性,研究表明,已鉴定出的蛋白参与氧化应激耐受、Ca2+信号转导和转录调控、蛋白质降解、细胞壁和DNA/RNA/蛋白质的直接损伤,细胞凋亡和细胞分裂.Rainville LC[13]等利用蛋白质组学方法对柠檬酸包被的纳米银离子的毒性进行了评估,其结果表明了两种化合物之间的功能重叠,卵黄蛋白的一个最确定的特性是起应力传感器的作用.此外,相对于卵黄蛋白而言,当AgNO3诱导14-3-3 蛋白发生羟基化反应时,血红蛋白水平由于AgNP的暴露升高.该研究证实了以前观察到的纳米银粒子的急性毒性低,同时表明,银的两种形式的毒性随不同生物的途径,可能导致与水环境中的天然化合物或污染物的相互作用.
4. 结语
目前,国内外纳米银材料的生物学制品尚无完善的评估体系,如果能够基于iTRAQ技术结合MRM技术发现并确证有效的纳米银材料对于人体毒性的生物标志物,将极大程度地推进纳米银医用生物材料的评估体系建立.iTRAQ技术可对2~8个不同的样本同时分析,相比较于目前蛋白质组学的其他方法有着不可比拟的优势,通过iTRAQ技术对纳米银材料进行的全面的蛋白质组学研究,良好的重复性、可信性以及敏感性,其结合MRM技术进行大规模的生物标志物的验证和临床确证都证明了该两项技术的结合将会在纳米银生物医学材料毒性的评估方面有所作为.当然,iTRAQ 技术并非完美,因为,在同位素进行标记的同时就已经改变了检测物质的结构,这或多或少的会造成样本的误差.但是,我们有理由相信,随着iTRAQ技术的不断完善与发展,它不仅仅只限于在基础研究中发挥作用,其与MRM的结合在纳米银生物医学材料的毒性评估中极有可能发挥重要作用,从而实现纳米银材料评估历史上零的突破及质的飞越.
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蛋白质:蛋白质指纹图谱检测技术项目介绍
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（收稿日期：2014-09-01）
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蛋白质引用文献:
[1] 蛋白质和生物技术论文如何怎么撰写 关于蛋白质和生物技术方面论文范文素材5000字
[2] 蛋白质组学论文范文 蛋白质组学类论文写作技巧范文3000字
[3] 蛋白质论文范文 关于蛋白质类研究生毕业论文范文5000字
