《酶法制备壳寡糖工艺优化与抗氧化能力分析》
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摘 要：以壳聚糖为制备原料,利用壳聚糖酶水解壳聚糖来制备壳寡糖.通过单因素试验结果分析可以得出反应时间、壳聚糖酶添加量、温度、pH等4个因素对酶解作用的影响.采用正交法设计4因素3水平的试验,将壳寡糖产率作为检测结果,做正交试验分析,优化工艺条件,从正交分析结果得到最佳工艺条件如下：反应时间4h、酶添加量2000U/g、温度35℃、pH5.0.通过验证试验可以得到最佳工艺条件下还原糖浓度最高,即壳寡糖的产率最高,为1.884%.利用壳寡糖对清除羟自由基的能力试验和还原能力试验,验证了壳寡糖具有一定的抵抗人体氧化衰老的能力.
关键词：壳聚糖酶;壳寡糖;正交试验;抗氧化
中图分类号 TS201.3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）06-0028-05
Abstract： In this experiment, chitosan was used as a raw material to prepare chitosan oligosaccharides by using chitosanase to hydrolyze chitosan. Observing the results of single factor experiments, we can conclude that the reaction time, the amount of chitosan enzyme, temperature, and pH affect the enzymatic hydrolysis. The orthogonal experiment was used to design the four-factor three-level experiment. The chitosan oligosaccharide yield was taken as the test result. The orthogonal experimental analysis was conducted to optimize the process conditions. The optimum process conditions from the orthogonal analysis results were as follows： reaction time 4 h, enzyme Adding amount 2000 U/g, temperature 35℃, Ph5.0. Through verification experiments, the highest concentration of reducing sugars can be obtained under the optimal conditions, that is, the highest yield of chitosan oligosaccharides is 1.884%. Experiments using the ability of chitosan oligosaccharides to scenge hydroxyl radicals and experimental studies of reducing power he demonstrated that chitooligosaccharides he a certain ability to resist oxidative aging in humans.
Key words： Chitosanase; Chitosan oligosaccharide; Orthogonal test; Antioxidation
壳寡糖（Chitosan oligosaccharide）,又名寡聚氨基葡糖、甲壳低聚糖,是2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接起来的小分子聚合物[1].壳寡糖是壳聚糖的水解产物,其在水中的溶解度好,生物可利用度高,具有独特的生理活性和功能,现已广泛应用于食品、生物医药和化妆品中[2-3].壳寡糖具有一定的还原性,由于还原能力越强,抗氧化衰老的能力就越强,使得其具有较强的抗氧化活性.壳寡糖抗氧化性的应用广泛,目前已在动物饲料和食品安全,蔬果的贮藏和保鲜以及医药保健等方面发挥着重要的作用,尤其是在生物医药与保健领域.由于壳寡糖具有良好的抗氧化活性,为其在降脂、降糖以及肝功能保护方面提供了良好的应用前景[4].但由于当前壳寡糖在制备方面还没有多大的突破,产量过低,从而导致过高,因此,提高其制備产量的方法已成为了国内外研究和开发的热点.
目前,对壳聚糖的降解方法大致分为酸降解法、酶降解法和氧化降解法3大类[5].其中,酸降解法的工艺繁琐,反应产物单糖较多,壳寡糖产率较低,并且不易操作控制,对环境具有一定的污染;酶降解法反应条件温和,无其他副反应,易操作控制,是工业化制备壳寡糖最具前景的方法.酶降解法一般可分为非专一性酶降解和专一性酶降解[6,8],其中非专一性酶包括脂肪酶、纤维素酶[7]等对壳聚糖的降解不充分,对酶的消耗量大,产物复杂且很难分离;专一性酶包括壳聚糖酶、甲壳质酶等的反应条件适宜,容易调控,是一种很好的壳寡糖制备方法.壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成壳寡糖,壳聚糖酶在降解壳聚糖多聚物,大规模生产壳寡糖中发挥着重要的作用[9-13].
本试验以壳聚糖作为原料,对其进行酶解制备壳寡糖,通过单因素试验和正交试验的结果构建制备壳寡糖工艺条件的数学模型,由此得出优化的最佳工艺条件组合,再利用壳寡糖对清除羟自由基的能力的试验和其还原能力的试验来考察其抗氧化能力.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 壳聚糖（脱乙酰度80%）,北京中生瑞泰科技有限公司生产;壳聚糖酶（酶活力40000U/g）,诺维信生物科技有限公司生产;三氯乙酸（分析纯）,上海展云化工有限公司生产;D-氨基葡萄糖,SIGMA公司生产;氢氧化钠、无水亚硫酸钠、乙酸钠、乙酸、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、铁、磷酸二氢钾等,国药集团化学试剂有限公司生产.
1.2 仪器 DL-5低速大容量离心机,上海安亭科学仪器厂生产;旋转蒸发器RE-52A,上海亚荣生化仪器厂生产;紫外-可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司生产;DK-S22型电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司生产;电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司生产;电子天平,上海海康电子仪器厂生产.
1.3 试验方法
1.3.1 还原糖标准曲线的绘制 参照刘玥等[14]的方法进行DNS试剂和氨基葡萄糖标准液（1.0mg/mL）的配制,得到标准曲线如图1所示.回归方程为：y等于0.7155x-0.0265,R2等于0.9981,作为定量分析的标准曲线.
1.3.2 壳寡糖的制备 精密量称量2.0g的壳聚糖于500mL烧杯中,加入一定量的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.2mol/L）,搅拌形成胶体溶液,固定底物浓度为2%（w/v）,再加入一定量的壳聚糖酶酶解壳聚糖.通过加入缓冲溶液的体积不同,可以使烧杯中溶液置于不同pH值下.分别在不同温度、不同pH、不同酶添加量下酶解一段时间,之后迅速把酶解液置于100℃沸水中,保持5min使酶灭活,然后离心取上清液,测出上清液中的还原糖浓度,计算壳寡糖的产率,然后将上清液过滤纯化,使用旋转蒸发仪浓缩过滤液,当浓缩掉2/3过滤液后,将剩余的过滤液使用无水乙醇洗涤后,烘干得到壳寡糖.
1.3.3 还原糖含量的检测 酶解液中还原糖含量的测定方法与上述标准曲线的制定方法一致,将氨基葡萄糖标准溶液改为待测样品,其他步骤不变,得到相应的还原糖浓度.壳寡糖提取率的计算公式如下：
壳寡糖产率（%）等于还原糖含量/壳聚糖含量×100
1.3.4 清除羟基自由基的能力测定 取5支试管,编号为1～5,准确量取0.2mL的FeSO4-EDTA混合液（10.0mmol/L）加入到每支试管中,并再分别向每支试管加入0.5mL的2-脱氧核糖溶液（10.0mmol/L）、0.5mL磷酸缓冲液（0.1mol/L pH7.4）、0.2mL的H2O2溶液（10.0mmol/L）和0.6mL一定浓度的壳寡糖溶液（浓度梯度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL）,混合均匀,放入37℃水浴锅中水浴1h后,向每支试管加1.0mL的2.8%（w/w）三氯乙酸溶液,在离心速度为4000r/min和离心温度4℃条件下离心20min,均量取上清液2.0mL相对应的放入编号①～⑤的试管中,向编号①～⑤的每支试管加入1.0mL的1.0%（w/w）硫代酸溶液后,混合均匀,在沸水中水浴15min,冷却后稀释5倍,将可见紫外分光光度计的波长调为532nm,分别测出编号①～⑤的每支试管溶液的吸光度.羟自由基清除率的计算公式如下：
清除率（%）等于（Ac-As）/（Ac-A0）×100
式中：Ac：不加壳寡糖的吸光度;As：加壳寡糖的吸光度;A0：试剂空白的吸光度.
1.3.5 还原能力的测定 准确量取0.6mL 200mmol/L的pH6.6磷酸缓冲溶液加入到烧杯中,再分别加入0.6mL一定浓度的壳寡糖溶液（浓度梯度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL）和2.5mL 1%铁（质量分数为1%）,混合均匀,在50℃水浴锅中水浴20min,快速冷却,加入0.6mL三氯乙酸（质量分数为10%）,在离心速度为4000r/min和离心温度4℃条件下离心10min,量取上清夜1mL,分别加入1mL的水和0.2mL三氯化铁（质量分数为0.1%）,混匀后静置10min,将可见紫外分光光度计的波长调为700nm,测定吸光度.
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 温度对酶解制备壳寡糖效果的影响 在酶浓度为1600U/g,反应时间2h,pH5.4的酶解条件下,得到壳聚糖酶在不同温度下水解壳聚糖的效果,结果如图2所示.从图2可以看出,还原糖浓度随温度的上升而呈现出先增加后减少的趋势.其中,在30～35℃,还原糖浓度随温度的上升而缓慢增加;在35～40℃,还原糖浓度随温度的上升而急剧增加,且在40℃还原糖浓度达到最高;当温度高于40℃,还原糖浓度开始下降,且随着温度的持续增加,还原糖浓度越来越低.因此,溫度在40℃左右时,制备壳寡糖的效果最好.该酶在酶添加量1600U/g,反应时间2h,pH5.4的酶解条件下的最适温度为40℃.其原因可能是随温度的不断增加,酶的活性也随之增加,酶解的速率加快,提高了还原糖浓度.而当温度高于40℃时,酶的活性开始出现下降趋势,导致还原糖浓度下降.
2.1.2 pH对酶解制备壳寡糖效果的影响 在酶浓度为1200U/g,反应时间2h,温度40℃的酶解条件下,得到壳聚糖酶在不同pH下水解壳聚糖的效果,其结果如图3所示.从图3可以看出,还原糖浓度随pH的增加而呈现出先上升后下降的趋势.其中,在pH3.8～4.2,还原糖浓度随pH的上升而缓慢增加;在pH4.2～5.0,还原糖浓度随pH的上升而急剧增加,并且在pH5.0时还原糖浓度达到最高;当pH超过pH5.0,还原糖浓度开始逐渐下降.因此,pH在5.0左右的范围,酶解效果较好.这说明,pH对酶解制备壳寡糖效果具有极显著的影响,并且壳聚糖酶降解的最适pH为5.0.其可能原因是随pH的增加且未到达最适pH之前,酶活性逐渐增加,反应速率加快;当pH过高,超过最适pH,酶的活性开始下降直至酶失活,酶解速率下降.
2.1.3 反应时间对制备壳寡糖酶解作用的影响 在酶浓度1600U/g,pH5.0,温度40℃的酶解条件下,得到壳聚糖酶在不同反应时间下水解壳聚糖的效果,其结果如图4所示.从图4可以看出,随着反应时间的增加,还原糖浓度也逐渐增加,在1～3h范围内还原糖浓度上升速率较快,而在3～4h范围内上升缓慢,在酶解4h时,降解效果最好,还原糖浓度升到最高,随着酶解时间的不断增加,还原糖浓度有小范围的下降.因此,酶解时间4h为最优选择.
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