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沃柑和黄龙风景名胜区论文范文

《沃柑黄龙病亚洲种NestedPCR检测和调查分析》

该文是沃柑和黄龙风景名胜区类有关毕业论文提纲范文和调查有关论文范文例文.

摘要：【目的】探究沃柑感染黃龙病的田间症状表现及各症状与感染黄龙病的相关性,为种植者尽早鉴别黄龙病树和及时做好黄龙病防控工作提供参考依据.【方法】从广西不同地区沃柑果园采集沃柑黄龙病疑似样品,对样品按症状分类并记录,用试剂盒法提取叶脉和果柱基因组DNA,采用黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2进行巢式PCR（Nested-PCR）扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计不同症状样品的阳性率.【结果】收集的214份黄龙病疑似样品中,不同症状样品均检出黄龙病亚洲种病原菌,检出阳性率表现为典型红鼻子果等于斑驳黄化叶>果蒂稍红果>均匀黄化叶>叶脉黄化叶>僵果>缺锌黄化叶>其他黄化叶>正常叶.各症状类型与感染黄龙病均存在相关性,但存在差异,其中,典型红鼻子果和斑驳黄化叶阳性率均为100.0%,与感染黄龙病相关性最大;其次果蒂稍红果阳性率为90.9%,与感染黄龙病相关性很大;夏、秋梢均匀黄化叶阳性率为46.5%,与感染黄龙病相关性大.沃柑感染黄龙病后症状复杂,大多出现两种以上复合症状,结果树最初症状为出现果蒂稍红果,落果较多,未结果树以夏、秋梢黄化居多,根系容易受损;正常叶阳性率达16.7%,说明沃柑感染黄龙病早期不易显症.【结论】沃柑出现典型红鼻子果和斑驳黄化叶,可田间诊断为黄龙病树;出现果蒂稍红果,并严重落果,基本可田间诊断为黄龙病树;夏、秋梢均匀黄化黄龙病检出率高,但确诊还需与其他疑似症状（叶脉黄化叶、僵果、缺锌黄化叶、其他黄化叶和正常叶）一样通过PCR进一步检测.Nested-PCR检测技术灵敏性高,可作为沃柑感染黄龙病的早期鉴定技术.

关键词：沃柑;黄龙病病原;Nested-PCR检测;调查分析

中图分类号： S685.99 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）01-0101-07

Abstract：【Objective】The symptoms of Orah infected with Huanglongbing（HLB）and the correlation between the symptoms with HLB were studied in order to provide reference for growers to identify HLB from Orah as early as possible, and to prevent in time. 【Method】The leaf samples of suspected HLB in Orah orchards in different places in Guangxi were collected, then classified and recorded by symptoms. Genomic DNA of leaf vein and fruit column was extracted by kit and Nested-PCR amplification was conducted by special primers of 16S rDNA gene of Candidatus Liberibacter asiaticus（fD1/fD2 and OI1/OI2）. The results of PCR amplification were detected by 1% agarose gel electrophoresis and the positive rate of samples with different symptoms was calculated. 【Result】Among the 214 suspected samples of HLB collected, the samples of different symptoms were detected Candidatus Liberibacter asiaticus, and the positive rate presen-ted as typical red nose fruits等于mottled yellow lees>fruit stalkslightly red fruit>uniform yellow lees>lees with yellow central vein>stone fruits>zinc deficiency yellow lees>other yellow lees>normal lees. All the symptoms were correlated with HLB,but the correlations were different. Red nose fruits and mottled yellow lees had the positive rate of 100.0% and had maximal correlation with HLB. Fruit stalks lightly red fruit had positive rate of 90.9%, which was highly correlated with HLB. Uniform yellow lees in summer and autumn had positive rate of 46.5% and had strong correlation with HLB. After infection of HLB, the symptoms were complex, most of trees presented two or more complex symptoms. The initial symptoms of trees with fruits were fruit stalks lightly red fruits with a large number of fruit dropping. Most of the unfruited trees were yellowing in summer and autumn, and their roots were easily damaged. The positive rate of normal leaf was 16.7%, indicating that it was not easy to show symptomsin the early period of infection of HLB. 【Conclusion】When there are typical “red nose” fruits and mottled yellow lees on Orah, it can be diagnosed as HLB. When the fruit stalk appears slightly red, and the fruits drop seriously, it can be basically diagnosed as HLB. The detection rate of yellowing summer and autumn shoots is high, but to be diagnosed, it needs to be detected by PCR with other symptoms（lees with yellow central vein,stone fruits, zinc deficiency yellow lees,other yellow lees andnormal lees. Nes-ted-PCR is a method with high sensitivity, which can be an early identification for Orah infected with HLB.

Key words： Orah; Huanglongbing pathogen; Nested-PCR detection; investigation

Foundation item： Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA18118046-2,GuikeAA17204097-8）;Nanning Science Research and Technology Development Project（20182198-2）;Guangxi Academy of Agricultural Sciences Basic Research Special Project（Guinongke 2015YT51）

0 引言

【研究意义】沃柑由中国农业科学院柑桔研究所于2004年从韩国引进,该品种来源于以色列的Orah,是坦普尔桔橙与丹西红桔的,属宽皮柑橘类型（江东和曹立,2011）,于2012年引进广西种植,表现性状好,具有晚熟、树势强旺、耐寒、耐旱、产量高、果实品质优和耐贮运等优点（黄其椿等,2014;赵洪涛等,2016）.近几年来,由于沃柑种植效益高,产业发展迅猛,截至2017年广西沃柑种植面积达5.3万ha,其中主产区南宁市武鸣区有2.1万ha,2018年广西沃柑种植面积持续高速增长,据有关专家估算约达10.0万ha,广西已成为全国最大的沃柑产区和输出地.随着沃柑产业的快速发展,良种苗木供不应求,但苗木市场乱象丛生,加上其他行业从业人员转行种果,缺乏对黄龙病的认识和辨别能力,给沃柑产业发展埋下了隐患.柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一（柏自琴和周常勇,2012）,其病原是一种限制于韧皮部的革兰氏阴性细菌,还未能人工培养（马瑞丰等,2016）.目前柑橘黄龙病尚无有效的防治药剂,属可防可控不可治病害,其综合防控措施主要是种植无病苗、严防柑橘木虱、砍伐病树和种植隔离带等.因此,鉴别黄龙病树是做好沃柑产业黄龙病防控工作的前提,而调查并了解沃柑感染黄龙病的表现症状,分析各症状与感染黄龙病的相关性,可提高黄龙病田间诊断准确率,尽早鉴别黄龙病树,对沃柑生产中防控黄龙病具有较大的指导意义.【前人研究进展】柑橘黄龙病会引起柑橘叶片变厚、变小且黄化,包括均匀黄化、斑驳黄化、缺素黄化等,果实变小、畸形、着色不均,常现红鼻子果,种子败育,根系须根少,新根生长受到抑制,支根腐烂等（肖翠等,2017）.感染黄龙病后,植株并不立即显症,存在潜伏期,潜伏期的长短因品种、树龄、健康状况、种植环境等而异（马瑞丰等,2016）,且不同品种田间表现症状不尽相同.金柑黄龙病症状既有斑驳叶和红鼻果,也有缺锌、缺锰状叶片,但斑驳叶较少,而且多为分散碎斑驳,一般不会形成一大块完整的黄斑和一块完整绿斑相间的斑驳状,红鼻果则非常典型,表现为果实果蒂部位、果肩周围橙红色,其余青绿色,果小、变软,严重时果实表皮失水皱缩（邓光宙等,2007）.脐橙黄龙病初期在植株树冠的个别或少数夏秋梢出现黄化,以后逐步全株黄化,叶片症状有斑驳型黄化和缺素状黄化,偶见均匀黄化,发病初期根部基本正常不会腐烂,随着病情的发展,地上部出现干枯,根系也开始腐烂、变黑,继而地上部全部枯死（王道平和江映锦,2009）.琯溪蜜柚黄龙病的叶片症状有叶片斑驳黄化、均匀黄化、类似缺素黄化等多种黄化症状,但典型症状“叶片斑驳黄化”表现比其他柑橘品种更明显,病果前期症状不明显,采收期明显偏小、油胞增粗,外观不显现红鼻果症状（李美桂,2010）.沙田柚主要病状为初期病树黄梢和叶片斑驳型黄化,病叶容易脱落,病果变小、畸形、着色不均匀（李小轩,2011）.砂糖橘黄龙病症状有黄梢、斑驳黄化叶、缺素状黄化叶、红鼻子果,均匀黄化叶在初期发病树春、夏、秋梢上发生,病果为红鼻子果,小而畸形,略呈长圆形,病树根部初期正常,后期出现烂根（黄海,2018）.长期以来对柑橘黄龙病主要是根据田间症状进行诊断,其典型症状有黄梢、斑驳黄化叶、红鼻子果（王爱民和邓晓玲,2008）,但不同品种表现症状与感染黄龙病的相关性存在差异,分析黄龙病症状与PCR检测结果的相关性有助于提高黄龙病的田间诊断准确率.张培（2009）利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对砂糖橘疑似样品进行检测,发现砂糖橘红鼻子果样品韧皮部杆菌（Candidatus Liberibaeter asiaticus）阳性检出率高达100.0%,病树上无症状果实、斑驳叶片及黄化叶片样品阳性检出率分别为27.3%、91.8%和52.0%.王茜等（2013a）利用巢式PCR（Nested-PCR）技术对南丰蜜桔不同症状黄龙病疑似样品进行检测,结果表明斑驳型黄化叶、缺锌状黄化叶、其他黄化叶和正常叶疑似样品阳性率分别为82.0%、31.6%、22.9%和8.6%.许美容等（2016）研究发现,斑驳型黄化、均匀黄化和绿岛3种叶部症状及红鼻子果和畸形果2种果实症状的PCR病原检出率高,阳性率分别为85.62%、85.00%、84.20%、93.10%和78.57%.【本研究切入点】沃柑是新引进品种,其感染黄龙病后表现症状、各症状与感染黄龙病的相关性研究尚未见文献报道,均是参照其他柑橘品种感染黄龙病的症状来鉴别,然而柑橘黄龙病症状较复杂,其表现随季节、树龄、品种等不同存在差异（许美容等,2016）.2017年冬季,广西多地沃柑果园出现果蒂稍红果,仅果蒂处一点红,并落果严重,不同于以往常见的典型红鼻子果,其果型、大小正常,且果枝上葉片大小、颜色均正常;2018年夏季,沃柑果园出现夏梢全部黄化、根系腐烂等现象,冬季出现僵果,但斑驳叶片较少,与其他柑橘品种感染黄龙病的表现症状差异较明显,一时无法诊断,需要通过PCR检测来确诊.【拟解决的关键问题】采集广西不同地区沃柑果园黄龙病疑似样品,对样品按症状分类并记录,利用Nested-PCR检测技术对样品进行检测,统计不同症状样品的阳性率,分析不同表现症状与感染黄龙病的相关性,旨在了解沃柑感染黄龙病的黄龙病田间表现症状,以及各表现症状与感染黄龙病的相关性,从而提高黄龙病田间诊断准确率,为种植者尽早鉴别黄龙病树,及时做好黄龙病防控工作提供参考.

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集沃柑黄龙病疑似叶样和果样分别于2017年10月—2019年4月采自广西南宁市武鸣区、邕宁区、江南区、西乡塘区、上林县和宾阳县,以及北海市、玉林市和河池市的沃柑果园.

1. 1. 2 引物采用黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2（Chen et al.,2009）,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

1. 1. 3 基因组DNA提取试剂盒采用快捷型植物基因组DNA提取系统,DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司.

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品处理与保存对所采集样品按照症状进行分类、拍照、整理.叶样取叶片主叶脉,果样取果实中柱,每份100 mg,用液氮研磨至粉末状,于 -20 ℃保存待用.

1. 2. 2 DNA提取叶片主脉和果柱DNA提取均参考王茜等（2013b）的方法.

1. 2. 3 PCR扩增反应体系及条件 PCR扩增反应体系与条件参考黄宏明等（2016）专利方法.

1. 2. 4 PCR扩增产物的检测取1.5 μL 6×Loa-ding Buffer与4.5 μL第二轮PCR产物混合均匀后上样,在1%琼脂糖凝胶电泳,电压110 V,1×TAE电泳缓冲液,电泳20 min后,在FIRE READER XS D-56-26M凝胶成像系统下观察拍照.

2 结果与分析

2. 1 疑似样品症状分类结果

共收集214份黄龙病疑似样品,其中典型红鼻子果7份、斑驳黄化叶16份、果蒂稍红果11份、均匀黄化叶54份、叶脉黄化叶11份、僵果6份、缺锌黄化叶20份、其他黄化叶53份和正常叶36份.疑似样品症状类型见图1.

2. 2 DNA提取和Nested-PCR检测结果

用天根生化科技（北京）有限公司快捷型植物基因组DNA提取系统提取的DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2）显示,条带清晰明亮,符合黄龙病病原Nested-PCR检测要求.Nested-PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3）显示,感染黄龙病病原样品的Nested-PCR产物条带明亮,能清楚地鉴别疑似样品是否感染黄龙病亚洲种病原菌.

2. 3 沃柑感染黄龙病的田间症状表现

调查发现沃柑感染黄龙病后症状复杂,大多出现两种以上复合症状.结果树感染黄龙病的最初表现症状为出现果蒂稍红果,落果较多,但果实大小、果型正常,果枝上叶片不表现症状,看似正常叶,且近几年来此种现象较多.感染黄龙病较严重的结果树果实生长缓慢,严重落果,并出现典型红鼻子果和畸型果（果形不正和斜肩症状）等,病果汁少味淡而酸,新梢缺素（缺锌较多）,叶片变小、枝条变短,老叶出现斑驳黄化叶.未结果树以枝梢黄化为主,其中夏、秋梢黄化较多,主要症状是新梢不转绿,出现全部均匀黄化,其次是全部缺素黄化、部分枝梢黄化或单支黄化等,症状较轻的老叶正常,根系受损,严重的上一级枝梢叶片出现退绿斑,呈现“绿岛”症状,根系坏死,叶脉黄化,树势衰退,相对其他品种,斑驳叶片较少（表1）.

2. 4 沃柑黄龙病疑似样品症状类型与感染黄龙病的相关性

根据Nested-PCR检测结果（表2）,典型红鼻子果、斑驳黄化叶、果蒂稍红果、均匀黄化叶、叶脉黄化叶、僵果、缺锌黄化叶、其他黄化叶和正常叶等不同症状黄龙病疑似样品均检出黄龙病亚洲种病原菌,说明沃柑感染黄龙病后其表现症状多样化.由表2可知,不同症状黄龙病疑似样品阳性率存在差异,阳性率表现为典型红鼻子果等于斑驳黄化叶>果蒂稍红果>均匀黄化叶>叶脉黄化叶>僵果>缺锌黄化叶>其他黄化叶>正常叶,其中典型红鼻子果和斑驳黄化叶黄龙病亚洲种病原菌检测阳性率为100.0%,田间基本可以诊断为黄龙病树（王爱民和邓晓玲,2008）;其次果蒂稍红果的黄龙病亚洲种病原菌阳性率高达90.9%,说明该症状与感染黄龙病的相关性很大,可作为田间诊断沃柑感染黄龙病的重要参考依据;均匀黄化叶、叶脉黄化叶、缺锌黄化叶和其他黄化叶也检出黄龙病亚洲种病原菌,说明这几种症状均与感染黄龙病存在一定的相关性,其中均匀黄化叶样品中有43份为夏梢和秋梢均匀黄化,其阳性样品20份,阳性率为46.5%,与感染黄龙病相关性大;正常叶阳性率为16.7%,与感染黄龙病也存在相关性;有部分沃柑僵果中检测到黄龙病亚洲种病原菌,分析原因是沃柑树感染黄龙病的同时感染了其他病害.

2. 5 不同季节沃柑新梢黄化叶与感染黄龙病的关系

2018年夏季分别从武鸣宁武镇、城厢镇、罗波镇、里建镇和仙湖镇采集沃柑夏梢全部黄化的黄龙病疑似样品,检出的阳性率分别为80.0%、50.0%、50.0%、36.4%和0,合计样品31份,阳性样品15份,检测阳性率为48.4%.2017和2018年秋梢黄化黄龙病疑似样品检测阳性率为22.7%,2019年春梢黄化黄龙病疑似样品检出阳性率为0（表3）.夏、秋梢黄化均与感染黄龙病相关,其中,夏梢黄化叶检测阳性率较高,秋梢黄化叶检测阳性率较低,分析原因是秋梢黄化叶样品中包含了因缺素不转绿枝梢的缺素黄化叶.2019年春梢黄化叶检测陽性率为0,其症状为春梢不转绿,均匀黄化,枝梢变短,叶片变小,上一级枝梢出现退绿现象,原因有待进一步检测鉴定.

2. 6 不同地区沃柑黄龙病发生情况

从检测结果（表4）看,除南宁市宾阳县、贵港市和梧州市几个采样较少的点外,其他采样点的黄龙病疑似样品均检出黄龙病病原菌,其中南宁市江南区黄龙病疑似样品阳性率高达88.9%,其次是南宁市武鸣区、西乡塘区和上林县,北海市和玉林市的黄龙病疑似样品阳性率较高,在39.7%以上,说明沃柑感染黄龙病的普遍性和严重性,黄龙病依然是沃柑的主要病害之一,需加强黄龙病的综合防控工作,确保沃柑产业健康持续发展.

3 讨论

本研究采用Nested-PCR技术对沃柑黄龙病疑似样品进行检测,产物条带明亮,能清楚鉴别疑似样品是否感染黄龙病,且对于带菌但不显症的正常叶也能检出,与王茜等（2013a）对南丰蜜桔、黄宏明等（2014）对砂糖橘的研究结果一致,说明Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原.正常叶也能检出病原,原因是病原菌在寄主体内含量、分布不均造成,沃柑疑似样品正常叶中,黄龙病病原菌的阳性率达16.7%,比南丰蜜桔高近1倍,说明沃柑感染黄龙病后,相对其他柑橘品种,早期叶片不易显症,且未结果树开始显症时,斑驳黄化叶较少,新梢黄化居多,与其他很多生理病害和虫害症状类似,仅通过田间症状难以作出准确诊断.现有田间检测仪器主要是基于高光谱成像无损黄龙病检测技术的设备,一般操作简单,检测速度快,但存在假阳性和假阴性情况,会有误诊的情况发生（肖翠等,2017）.因此,Nested-PCR技术是沃柑感染黄龙病早期较理想的一项鉴定技术.

本研究发现沃柑结果树感染黄龙病的最初表现症状为出现果蒂稍红果,落果较多,但果实大小、果型正常,果枝上叶片不表现症状,与其他柑橘品种存在差异,但感染严重时,其典型红鼻子果与砂糖橘、南丰蜜桔、脐橙和金柑等表现一致,仅与柚类不同.树梢表现与砂糖橘相似,沃柑感染黄龙病初期黄梢在春、夏、秋梢上均有发生,但夏梢较严重,与脐橙存在差异,脐橙黄龙病初期樹冠只有个别或少数夏梢出现黄化,偶见均匀黄化;根系表现,沃柑感染黄龙病初期根系即受损,而砂糖橘和脐橙感病初期根部正常,后期才出现烂根;沃柑感染黄龙病初期斑驳黄化叶较少,与金柑一致,但严重时显症的斑驳叶片非常典型.

相关性分析方面,沃柑典型红鼻子果黄龙病阳性检出率为100.0%,与张培（2009）利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对砂糖橘疑似样品的检测结果一致,斑驳黄化叶在疑似黄龙病叶样中阳性检出率最高,与王茜等（2013a）利用Nested-PCR技术对南丰蜜桔不同症状黄龙病疑似样品的检测结果一致,说明沃柑与其他柑橘品种一样,典型红鼻子果和斑驳黄化叶与感染黄龙病的相关性最大,可作为田间诊断沃柑感染黄龙病的依据;其次,沃柑果蒂稍红果黄龙病阳性检出率也高达90.9%,相关性很大,可作为田间诊断沃柑感染黄龙病的重要参考依据.因2019年沃柑春梢均匀黄化叶未检出黄龙病,导致均匀黄化叶检测阳性率降为37.0%,原因有待进一步鉴定;除去春梢均匀黄化叶,夏、秋梢均匀黄化叶的阳性检出率为46.5%,与感染黄龙病相关性大.由于沃柑感染黄龙病后根系容易受损,老叶出现叶脉黄化,叶片退绿现象,叶脉黄化叶阳性检出率较高,为36.4%,与感染黄龙病相关性较大.此外,僵果、缺锌黄化叶、其他黄化叶和正常叶等黄龙病疑似症状也与感染黄龙病存在一定的相关性.但沃柑均匀黄化叶、叶脉黄化叶、僵果、缺锌黄化叶、其他黄化叶和正常叶等黄龙病疑似症状要确诊,还需通过PCR技术鉴定.

4 结论

沃柑出现典型红鼻子果和斑驳黄化叶与感染黄龙病相关性最大,可田间诊断其已感染黄龙病;沃柑出现果蒂稍红果与感染黄龙病相关性很大,结合树体情况,如出现严重落果,可田间诊断其为黄龙病树;未结果树夏梢均匀黄化黄龙病阳性检出率高,但与其他疑似症状（叶脉黄化叶、僵果、缺锌黄化叶、其他黄化叶和正常叶）一样需通过PCR进一步检测确诊,以免造成传播或误砍;沃柑感染黄龙病早期不易显症,且斑驳叶相对其他品种较少,Nested-PCR检测可作为沃柑感染黄龙病早期鉴定技术.

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（责任编辑麻小燕）

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