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作者简介：申红旗（1959.5-）男,推广研究员,疫病防控与质量安全研究岗位专家.shq@0518@sina.com
DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2015.11.010
牙鲆、大菱鲆传染性造血器官
坏死病病毒检测报告
申红旗,鲁梦雪,蒋红艳
（河北省水产养殖病害防治监测总站,河北石家庄050011）
牙鲆、大菱鲆是我省海水养殖主要品种,近年来在养殖生产过程中发生疫病时,使用抗菌类药物往往效果不佳.为摸清上述鱼病是否因病毒引起,今年4-5月,笔者采集了部分人工养殖的牙鲆、大菱鲆样品,进行了鱼传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）实验室检测,有关情况报告如下.
1.采样
4月中下旬,从我省沿海6个海水鱼养殖单位采集了牙鲆、大菱鲆成鱼样品11个,其中牙鲆样品5个,大菱鲆样品6个,每个样品1.5kg,冷藏运至实验室.
2.实验室检验
本实验采用逆转录-论文范文酶链反应（RT-PCR）检测方法.
2.1IHNV的分离
2.1.1制样按照GB/T18088-2000的规定,采取样品鱼的肝、肾、脾.
2.1.2样品处理制好的样品用组织匀浆器低温匀浆.匀浆后的样品按1∶10的最终稀释度悬浮于细胞培养液（含有1000IU/mL的青霉素和1000μg/mL的链霉素）中,4℃孵育过夜.7000r/min离心15min,收集上清液.
2.1.3IHNV分离处于对数生长期的FHM细胞以适宜密度接种至细胞培养板内,培养约24h.收集的样品上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释,然后将适当体积的稀释度为1∶10、1∶100、1∶1000的上清液分别接种至FHM单层细胞中（正对照为含阳性IHNV的病毒悬液；负对照为细胞培养液）,17℃吸附1h,再加入细胞培养液,置于17℃培养.7d内每天用导致显微镜观察并记录细胞是否出现病变.
2.2IHNV鉴定
2.2.1RNA提取及cDNA合成将对照细胞和有CPE的细胞冻融一次,取冻融后的细胞悬液按GB/T15805.2-2008的方法抽提RNA,抽提好的RNA按下列程序进行反转录,反转录体系及程序如下：
体系中加入10μL模板,2.5μLR1,2.5μL水,共15μL,70℃反应5min,立即冰浴,瞬时离心；再加入5μL逆转录酶浓缩缓冲液（5x）,2μLdNTPs,0.5μLRI（20U）,1μLAMV（10U）,1.5μL水,共25μL,42℃反应1h,产物作为模板.
2.2.2套式PCR见表1.
反应体系在PCR扩增仪中按照94℃预变性4min,再94℃1min,55℃1min,72℃1min,30次循环,然后72℃8min,最后4℃保温的程序反应.
2.2.3琼脂糖电泳8μLPCR产物+2μL5xloadingbuffer混样,混好的样点入TBE缓冲液配制成的1.5%的琼脂糖凝胶孔内,5V/cm电泳约40min.凝胶成像仪中观察并拍照记录.
3.检验结果
3.1接种细胞培养结果
待测样品接种细胞后3～4d,编号0075、0076、0078、0079、0080的5个样品细胞培养中出现细胞病变（CPE）,0077未发生病变.见图1.
3.2PCR检测结果
第1步PCR：
第2步PCR：
3.3基因测序结果
5.个阳性样品PCR代谢物送有关单位基因测序,符合率98%.
4.小结
采集的11个牙鲆、大菱鲆样品中,共检出IHNV阳性5例,IHNV阳性检出率为45.45%.其中牙鲆IHNV阳性2例,阳性率40.00%,大菱鲆牙鲆IHNV阳性3例,阳性率50.00%；6个养殖单位中有2个单位的样品检出IHNV阳性,检出率为33.33%.详见表2.
本次检测实验证明,我省养殖的部分牙鲆、大菱鲆体内存在传染性造血器官坏死病病毒.IHN是农业部公告第1125号规定的二类水生动物疫病,具有很强的传染性与危害.因此,在牙鲆、大菱鲆养殖苗种阶段应做好检疫工作,避免引进带有IHNV阳性的鱼苗.养殖过程中如发现鱼眼球突出、浑身出血等症状,应考虑感染IHN疫病的可能性,使用聚维酮碘等抗病论文范文物进行防控.
大菱鲆饲料:海水养殖[3]大菱鲆养殖技术
（收稿日期：2015-08-31）
总结：本文关于大菱鲆样品论文范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考。
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