《产广谱细菌素芽孢菌筛选和鉴定》
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摘 要为筛选出可产抑菌肽的芽孢菌,采用稀释涂布、平板划线的方法从土壤、泡菜、湖泥等10种样品中分离纯化菌种,利用抑菌圈法筛选出有4株抑菌性的芽孢菌,对抑菌效果最好的菌株J11通过菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验以及16SrDNA测序鉴定,表明其为多粘类芽孢杆菌,并进一步测定J11的抑菌谱,结果表明其对大肠杆菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸杆菌、乳酸链球菌均具有一定的抑菌性.尤其对溶酪巨型球菌的抑菌圈直径达30.13 mm,抑菌作用非常明显.J11具有良好的抑菌性,具有广谱抑菌效果,对常见的致病菌和腐败菌都有一定的抑菌性,在食品保藏中具有一定的应用价值.
关键词筛选;细菌素;芽孢菌;抑菌性
中图分类号TS202.3文献标识码A文章编号0517-6611（2020）01-0173-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.052
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Screening and Identification ofBacillus Strain Producing Bacteriocin
MAN Wenzeng, HU Rong, FENG Sizhong et al
（Department of FoodScience andEngineering, Nanjing Normal University, Nanjing,Jiangsu 210097）
AbstractIn order to screen Bacillus strain producing bacteriocin, four Bacillus strains were isolated and purified from soil, pickles, lake mud and other samples by dilution coating and plate marking. Antibacterial bacteria were screened by the method of bacteriostasis circle. The bacterial strains were identified by colony morphology, gram staining, spore staining, physiological and biochemical experiments and 16SrDNA sequencing. Finally, the bacteriostasis circle was used to determine the bacteriostasis circle size of the strains against various indicator bacteria and the bacteriostasis spectrum was obtained. The best bacteriostasis strain J11 was identified as Bacillus polymyxa. J11 was tested for Enterobacter, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Caseinolyticus megacoccus, Pentosacoccus, Lactobacillus Switzerland and Streptococcus lactis. The bacteria had certain bacteriostasis. The diameter of bacteriostasis circle for Megacoccus casei was 30.13 mm, which was extremely sensitive to bacteriostasis. J11 had good bacteriostasis and broadspectrum bacteriostasis effect, which had certain bacteriostasis to common pathogenic bacteria and spoilage bacteria, and had certain application value in food preservation.
Key wordsScreen;Bacteriocin;Bacillus;Antibacterial activities
微生物引起的食品腐败是改变食品物理化学性质、降低或失去食品营养价值和商品价值的过程,缩短了食品的货架期,同时也造成大量食品的浪费[1].寻找有效的食品防腐保鲜方法一直是人们研究的热点问题,使用防腐剂、灭菌处理以及采用一些特殊的包装方法可以抑制食品微生物繁殖,减慢食品变质的速度,其中使用化学防腐剂是目前最广泛的食品防腐方法,如使用苯甲酸钠盐、山梨酸钾盐等.但越来越多的研究表明化学防腐剂有一定的危害作用,朱沁玲等[2]研究苯甲酸钠多次给药对雌性大鼠肝脏、肾脏及卵巢毒性,发现苯甲酸钠多次给药对大鼠肝脏、肾脏的功能均有损害,浓度越高,毒性越大.化学防腐剂越来越不能满足人们对食品安全的高要求,人们也正在竭力寻找一些安全高效的天然防腐剂,如一些天然植物的提取物、中草药提取物[3-4],但天然植物抑菌物质存在提取率低的问题.细菌素作为一种生物性的天然防腐剂受到了广泛的关注,细菌素是细菌在代谢过程中产生的一类具有抑菌作用的多肽类物质,在人体内可被代谢分解,安全性很高.微生物种类繁多,是开发细菌素的丰富资源[5],其中芽孢菌环境适应性强且分布广泛,是产细菌素的潜力菌种[6-7].笔者利用稀释涂布和平板划线的方法从土壤、泡菜、湖泥等样品中分離纯化菌株,采用抑菌圈法筛选出具有广谱抑菌效果的产细菌素芽孢菌[8-10],并鉴定菌株种属,测量其抑菌谱,以期筛选到具有广谱抑菌效果的新菌株,扩大产细菌素菌种的同时促进天然防腐剂细菌素的开发和利用.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品.
土壤分别来自江苏南京、江苏连云港、湖北恩施、贵州遵义、安徽六安的农耕地;南京市玄武湖湖泥;南京上海路市售泡白菜、泡萝卜.
1.1.2培养基.
LB固体培养基、LB液体培养基、NA固体培养基;PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基、高氏一号培养基[11].
1.1.3指示菌.
微生物菌种均由食品系微生物实验室提供.以革兰氏阴性菌代表菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌代表菌金葡萄球菌作为抑菌性鉴定指示菌,其余作为抑菌谱测定的指示菌.
1.1.4主要仪器与设备.
CJ-2S超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）;
HVE-50高压灭菌锅（南京博惠科学仪器有限公司）;
HPX-9082 ME数显恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;
TH2-C恒温摇床（太仓市实验设备厂）;
TH4-200倒置荧光显微镜（南京奥力科学仪器有限公司）;
AUY200电子分析天平（日本ShiMADzu）;
PHS-3C精密pH计（上海三信仪表厂）;
DK-8D电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;
GL-ZZM高速冷冻离心机（赛特湘怡离心仪器有限公司）.
1.2方法
1.2.1菌种分离与筛选.
取1 g样品放入10 mL无菌水中充分混匀,80 ℃加热30 min杀死营养细胞,制成1∶10的样品匀液.然后用无菌水按10倍梯度稀释5个梯度浓度,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,每个梯度浓度吸取0.1 mL于LB固体培养基均匀涂布后置于37 ℃的培养箱中培养24 h.初步根据菌落形态判断不同的菌株,分别挑取不同的菌株进行划线纯化,划线3～4次得到纯种的菌株.
1.2.2抑菌试验.
细菌的抑菌性测定采用抑菌圈法,以抑菌圈直径判断其抑菌性的大小.
挑取纯种菌株接种到5 mL 的LB液体培养基中,置于37 ℃摇床培养18 h后作为种子液,将种子液按2%的接种量接种到50 mL液体培养基中37 ℃摇床培养18～22 h,取适量发酵液置于4 ℃、10 000 r/min的离心机中离心15 min去除细菌细胞,得到细菌的发酵上清液,取0.1 mL大肠杆菌、金葡萄球菌均匀涂布在NA固体培养基作为指示菌,用打孔器在每个培养基上打出3个孔,然后注入适量的发酵上清液,不宜溢出.置于37 ℃培养箱培养6～8 h后观察有无抑菌圈并测量抑菌圈直径[12-13]（抑菌圈直径包括打孔器直径,打孔器直径为8 mm）.
1.2.3细菌素检验.
取发酵上清液测量其pH,将酸性发酵上清调至碱性以排除有机酸的影响,做抑菌试验观察其抑菌圈大小变化.然后进行酶解试验,先取适量发酵上清液测量其pH,按1 mg/mL的比例分别加入蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶,调节pH到相应酶的最适pH（分别为7.4、6、7.4和2.0）后37 ℃水浴反应1 h,调回原液的pH后做抑菌试验,观察其抑菌圈大小变化[14].
1.2.4菌种鉴定.
对菌株进行革兰氏染色和芽孢染色[15],观察其颜色反应.将初步确定为芽孢菌的菌株送往菌种鉴定机构——生工生物工程（上海）股份有限公司进行16SrDNA测序鉴定其具体的菌属.
1.2.5抑菌谱测定.
将各种指示菌培养至对数期作为抑菌试验的指示菌,取J11的发酵上清液进行抑菌试验,测定其对各种指示菌的抑菌圈大小,得到J11的抑菌谱.
2结果与分析
2.1产细菌素菌株的筛选结果
通过细菌的分离纯化,从10种样品中分离筛选出48株纯种菌株,对该48株纯种菌株进行抑菌试验,获得16株具有一定抑菌性的菌株,表1为该16株菌株对大肠杆菌、金葡萄球菌的抑菌圈直径.其中J11、W1、Plb3、PC12这4株菌抑菌性较好,抑菌圈直径在15 mm以上.
2.2抑菌物质细菌素鉴定结果
为排除有机酸对微生物的抑菌作用,对抑菌性较好的J11、W1、Plb3、PC12进行排除有机酸试验,测得其发酵上清液的pH都大于7,呈碱性,可以有效排除有机酸的影响.对其发酵上清液进行酶解试验,酶解试验结果如表2所示,J11被胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解,W1、PC12能被蛋白酶K酶解, Plb3能被胰蛋白酶酶解.由此可确定J11、W1、Plb3、Plb3的抑菌物质是肽类物质细菌素.
2.3菌種鉴定结果
对抑菌最好的J11菌株进行菌种鉴定,革兰氏染色呈阳性,芽孢染色可以看到绿色芽孢以及细菌形态呈杆状,可以初步确认其为芽孢杆菌,PCR扩增J11的16SrDNA基因序列为1 494 bp,将J11的16SrDNA 基因序列碱基序列进行 Blastn和数据库中16SrDNA 序列进行核苷酸同源性比较,发现其与Paenibacilluspolymyxa IAM 13419 16SrDNA和PaenibacilluspolymyxaHBUAS57026 16SrDNA的序列相似率为99%.取上述序列和Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus kobensis、Bacillus cytotoxicus、Bacillus subtilis、Paenibacillus dauci、Paenibacillus massiliensis、Paenibacillus lautus、Paenibacillus hemerocallicola模式菌株的 16SrDNA 进行系统发育分析,构建了J11的系统发育进化树,结果如图1所示,确认J11为多粘类芽孢杆菌[16-18].
2.4抑菌谱测定结果
选择16种指示菌进行抑菌试验,得到J11的发酵上清液对大肠杆菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸杆菌、乳酸链球菌都有抑菌效果,抑菌圈直径如表3所示,其中对溶酪巨型球菌的抑菌性最敏感,抑菌圈直径达30.13 mm.J11抑菌效果见图2.
3结论
从湖泥中筛选出一株具有广谱抑菌效果的新菌株J11,通过对J11的发酵上清液进行排除有机酸和酶解试验,确定其抑菌物质为细菌素.对其进行革兰氏染色和芽孢染色以及16SrDNA测序,鉴定其为多粘芽孢杆菌.并测得其对大肠杆菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸杆菌、乳酸链球菌都有抑菌效果,具有广谱的抑菌性,且抑菌性良好,可抑制食品常见的腐败菌和致病菌,在食品防腐保鲜中有一定的使用价值.
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结论:这是一篇关于细菌素芽孢菌和筛选方面的细菌论文题目、论文提纲、细菌论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文.
细菌引用文献:
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