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（1江苏省如东县畜牧兽医站,江苏如东 226400； 2如东县洋口畜牧兽医站； 3扬州大学兽医学院）
摘 要 为探讨镉对原代大鼠肝细胞的毒性作用.用二步灌流法获得大鼠肝细胞,肝细胞暴露于浓度为2.5、5.0、10.0、20.0 μmoL/L的醋酸镉中12、24 h,应用四论文范文偶氮噻唑蓝（M论文范文）比色法检测醋酸镉对肝细胞存活率的影响及培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性变化.结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5.0、10.0、20.0 μmoL/L的醋酸镉中,细胞相对存活率显著下降（P<,0.01）,LDH的释放量增加,且具有剂量效应关系.提示一定浓度的醋酸镉可引起肝细胞的毒性损伤.
关键词 大鼠；肝细胞；醋酸镉；毒性
中图分类号 S856.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）15-0266-02
Study on Toxicity of Cadmium on Primary Culture Hepatocytes in Rats
YANG Jian-quan 1 MA Hong-bing 2 LIU Xue-zhong 3
（1 Animal Husbandry and Veterinary Station of Rudong County in Jiangsu Province,Rudong Jiangsu 226400； 2 Yangkou Animal Husbandry and Veterinary Station of Rudong County； 3 College of Veterinary Medicine,Yangzhou University）
Abstract In order to study the toxical effects of cadmium on primary culture hepatocytes in rats. Rat hepatocytes were isolated by a two step perfusion technique,the hepatocytes were incubated with cadmium acetate（2.5 μmoL/L,5.0 μmoL/L,10.0 μmoL/L and 20.0 μmoL/L）for 12 h and 24 h,methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（M论文范文）technique was used to determine hepatocytes cell viability in this study. The content of lactate dehydrogenase（LDH）in hepatocyte primary culture fluid were determined. The results showed that cell viability decreased significantly（P<,0.01）in a dose dependent manner after exposure to 2.5 μmoL/L,5.0 μmoL/L,10.0 μmoL/L and 20.0 μmoL/L cadmium acetate,the activities of LDH increased. It suggested that cadmium acetate may induce the damage of hepatocytes at certain doses.
Key words rat；hepatocytes；cadmium acetate；toxicity
镉属于高毒重金属,其在工业上广泛使用,但是排放进入环境后造成土壤和水体污染.更为严重的是,镉在自然环境中累积后进入食物链,对人体健康造成威胁.研究表明[1-2],镉可致肾、神经细胞等组织细胞受损,美国毒物药理委员会提出的危害人体健康的有毒物质中,镉排在第6位[3].通过啮齿动物研究证明,镉最初主要累积在肝脏,因此暴露毒性剂量的镉首先引起肝脏受损.镉主要引起多种细胞氧化损伤或凋亡,但是其所致机体损伤的机制较复杂,目前尚未明确.其主要特征是细胞活力的下降和细胞内乳酸脱氢酶（LDH）等酶的释放,其活性增高,同时细胞损伤还使细胞形态结构等方面发生变化.本研究探讨镉对大鼠原代培养肝细胞的毒性,通过对体外培养大鼠肝细胞进行低剂量镉试验,分析细胞存活率和凋亡率,旨在探明镉引起肝毒性的发生机制,并且为其防治提供依据.
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 仪器与试剂.供试仪器为：723N可见分光光度计（上海精科）、sunrise-basic型酶标仪（澳大利亚Tecan）等.试剂为：WME培养基（美国Invitrogen公司）；LDH试剂盒（南京建成科技有限公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物技术有限公司）；链霉素、地塞米松、胰岛素、醋酸镉、青霉素（美国Sigma-Aldrich公司）；牛血清白蛋白（BSA）、M论文范文、Trypsin（Amresco公司）；其他试剂均为国产分析纯.
1.1.2 试验动物.体重180～220 g的健康雄性SD大鼠,由扬州大学医学院实验动物中心提供.
1.2 试验方法
1.2.1 大鼠肝细胞的分离与培养.该试验部分参考Seglen[4]的二步胶原酶灌流法（稍作调整）.取SD大鼠,在禁食24 h后进行麻醉,以2％戊论文范文钠腹腔注射,以肝素钠腹腔注射抗凝.然后将大鼠于固定板上固定,腹部皮肤用酒精消毒后打开腹腔,将大鼠门静脉、下腔静脉远心端、上腔静脉分离并结扎,并从门静脉近心端插管,用留置针（连接于输液器）,先剪开下腔静脉的近心端,将上腔静脉扎上,用37 ℃ D-Hank′s液开放灌流SD大鼠肝脏,流速为25 mL/min,灌注约10 min,待肝脏变为土论文范文后,用37 ℃（灌流过程中保持灌流液的温度为37 ℃）、含0.18％胰酶的D-Hank′s液以流速为25 mL/min继续灌流10 min.停止灌流,取出肝脏,用PBS清洗3次,含链霉素100 mg/L和青霉素10万U/L（双抗）,放入Hank′s终止消化液中,含1％牛血清白蛋白（BSA）和双抗.收集肝细胞悬液,去除纤维结缔组织（血管、肝包膜等）.将肝细胞悬液过滤,筛网规格为100、200目,以700 r/min离心5 min,去上清液,用终止消化液重悬沉淀,再以500 r/min离心5 min,去上清液,在沉淀中加入WME完全培养基,含有胰岛素0.8 μmoL/L、链霉素100 mg/L、青霉素10万IU/L、地塞米松0.5 μmoL/L、胎牛血清100 mL/L.细胞活力检测,采用台盼蓝排斥法,并作细胞计数.选出细胞活力在90％的继续进行试验.
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1.2.2 镉对细胞存活率的影响.应用四论文范文偶氮噻唑蓝（M论文范文）法,在96孔培养板上接种细胞,约4 500个/孔,使其贴壁生长24 h,去上清后,加入不同浓度含醋酸镉无血清WME培养基（含醋酸镉0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmoL/L）,分别处理12、24 h后,加入5 mg/mL的M论文范文溶液20 μL/孔,培养4 h,去上清.加入二论文范文亚砜150 μL/孔,并振荡10 min,充分溶解紫色甲臜颗粒.在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值（OD）,选择测定波长和参考波长分别为540、630 nm.考查细胞存活率,公式如下：
细胞存活率（%）等于染毒组OD值/对照组OD值
1.2.3 镉对肝细胞形态学的影响.对肝细胞用分别用醋酸镉0、2.5、5.0、10.0 μmoL/L处理12、24 h后,观察细胞形态（用倒置显微镜）并拍摄照片.
1.2.4 细胞损伤标志酶的测定.将培养24 h的单层肝细胞,用不同浓度镉的无血清WME培养液继续培养,其镉含量分别为0、2.5、5.0、10.0 μmoL/L,培养温度为37 ℃,二氧化碳浓度为5%.培养过程中,分别于12、24 h时检测LDH活性（取细胞上清液）.按照LDH检测试剂盒说明书操作.
2. 结果与分析
2.1 大鼠肝细胞分离
低倍镜下观察刚分离的大鼠肝细胞（图1）,可见细胞数目众多,活细胞呈光亮圆形,饱满润泽,胞核清晰可见,透光度良好；由图2可知,肝细胞经台盼蓝染色,胞浆胞核均呈排斥状态,显示无色.试验分离的肝细胞成活率大于90%,平均每只大鼠肝获得约2×108个肝细胞.24 h后,由图3可知,呈单核或双核细胞,细胞体积增大,拉平变薄,部分细胞呈多边形展开或呈岛状连接.
2.2 镉对肝细胞存活率的影响
由图4可知,在对SD大鼠肝细胞以分别2.5、5.0、10.0、20.0 μmoL/L镉处理条件下,随着浓度加大,存活率降低,在培养12、24 h后,与对照（0 μmoL/L）相比,差异均为极显著（P<,0.01）.其12 h成活率分别为对照的83.1%、71.5％、64.0％、54.3%,24 h时的活力只有对照组的75.9%、63.7％、52.1％、40.1%,因此以下试验选择24 h时细胞存活率约为50%的10 μmoL/L镉为最大研究剂量.
2.3 镉对肝细胞形态学的影响
由图5可知,在对SD大鼠肝细胞以镉处理24 h,其形态变化较大.在0、2.5、5.0、10.0 μmoL/L镉处理条件下,肝细胞随着浓度增大和时间延长而急剧变形,细胞间隙增大,表现为细胞收缩变圆、皱缩,与邻近细胞分离,同时逐渐坏死.
2.4 镉对肝细胞培养上清液中LDH活性的影响
由表1可知,随着镉浓度的增大,LDH活性的释放量逐渐增加,与镉的剂量呈效应关系,12 h和24 h时5.0 μmoL/L和10.0 μmoL/L剂量组LDH活性与对照组（0 μmoL/L）相比均差异极显著（P<,0.01）.
3. 结论与讨论
3.1 大鼠肝细胞的分离
很长时间以来,国内外很多学者对肝细胞分离方法进行了大量的研究,但是仍然不容易获得高活率、功能好的肝细胞.虽然直接法分离得到的肝细胞数量较酶法低,但是可以满足一般试验的要求,而且该方法操作流程短,不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶.现在使用较多的是胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法等酶消化法.而使用较多的而且是目前国际上流行的是Seglen在前人方法的基础上建立的二步原位灌流法.在进行试验的过程中,肯定了胶原酶的消化能力和消化效果,也证明了用Ⅳ型胶原酶两步灌流法可得到大量纯度较高的肝细胞,但缺点是得到的肝细胞活力不高.研究结果表明,胶原酶分离的肝细胞的数量是胰酶的2.4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2.8倍,上述M论文范文试验结果表明胰酶分离的细胞活性明显高于胶原酶.因此,使用了胰酶进行灌注,获得的肝细胞存活率大于90%,可满足试验要求.
3.2 镉对肝细胞的毒性损伤作用
3.2.1 镉对肝细胞存活率的影响.细胞以凋亡的形式死亡是主动的程序化过程,在多细胞生物体内凋亡发挥着重要作用.当细胞受到损伤以后,其结构和功能会发生改变,最终将导致细胞死亡,因此细胞存活率是反映细胞受损程度的重要指标.本试验用M论文范文法检测镉对肝细胞存活率的影响,试验结果表明,Cd（Ac）2浓度在0~20 μmoL/L时,随着镉浓度的增大和肝细胞暴露于镉中时间的增长,肝细胞的存活率逐渐下降,12 h和24 h时各剂量染毒组与对照组的存活率差异均极显著（P<,0.01）,说明镉对肝细胞生长具有抑制作用,与Pham和Li等结果相似.
3.2.2 镉对肝细胞形态的影响.细胞在外界不良因素的影响下,会发生细胞死亡等情况,细胞形态会发生改变.本试验条件下,肝细胞暴露于镉中12 h或24 h,随着镉剂量的增加和暴露时间的延长,肝细胞急剧变形,表现为细胞皱缩、变圆和与邻近细胞分离,细胞间隙增大,坏死的细胞增多.
3.3 镉对肝细胞培养上清液中LDH活性的影响
LDH是胞浆内的一种酶,在细胞膜受损时,可从细胞内漏出,漏出的多少与细胞受损程度成正比,因此LDH漏出率常用作胞膜受损的指标[5-6].本试验结果表明,与对照组相比,分别用2.5、5.0、10.0 μmoL/L镉处理的SD大鼠肝细胞细胞活力均显著下降,LDH活性升高,说明镉增加细胞膜通透性,造成肝细胞损伤严重,引起肝细胞凋亡.
由此可见,镉可严重损伤肝细胞,但是镉引起凋亡的分子机制尚不明确,需进一步的探讨.
4. 参考文献
[1] 卞建春,路浩,梅莉.铅镉联合染毒对大鼠大脑皮质神经细胞的氧化损伤及NAC的保护效应[J].中国兽医科学,2008,38（9）：805-809.
[2] 卞建春,王富民,李慧敏.铅、镉染毒对SD大鼠的氧化损伤及乙酰半胱氨酸的保护作用[J].中国兽医学报,2008,28（7）：828-831.
[3] 刘杰.镉的毒性与毒理学研究进展[J].中华劳动卫生职业病杂志,1998,16（1）：224.
[4] SEGLEN P. Preparation of isolated rat liver cells[J].Methods Cell Biol,1976,13（1）：29-83.
[5] 夏世钧,吴中亮.分子毒理学基础[M].武汉：湖北科学技术出版社,2001：87-90.
[6] 汪纪仓,张英,裔传卉,等.镉对大鼠原代肝细胞的毒性损伤[J].中国兽医学报,2010,30（4）：527-529,559.
总结：该文是关于细胞存活率论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
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